第一節(jié)　結(jié)構(gòu)與分類
　　黃酮類化合物經(jīng)典的概念主要是指基本母核為2-苯基色原酮的一系列化合物?，F(xiàn)在，黃酮類化合物是泛指兩個苯環(huán)（A與B環(huán)）通過三個碳原子相互聯(lián)結(jié)而成的一系列化合物。其基本的碳架為C₆-C₃-C₆。
　　
　　一、苷元的結(jié)構(gòu)與分類
　　根據(jù)中央三碳鏈的氧化程度、B-環(huán)連接位置（2或3位）以及三碳鏈?zhǔn)欠癯森h(huán)等特點，可將中藥中主要的黃酮類化合物分類，如表6-1所示。
　　表6-1　黃酮類化合物的主要結(jié)構(gòu)類型

　　
　　例：在黃酮類化合物中，
　　A.三碳鏈的2,3位上有雙鍵，而3位沒有羥基
　　B.三碳鏈的2,3位上有雙鍵，而3位有羥基
　　C.三碳鏈的2,3位上沒有雙鍵，而3位沒有羥基
　　D.三碳鏈的2,3位上沒有雙鍵，而3位有羥基
　　E.三碳鏈的1,2位處開裂，2,3,4位構(gòu)成了αβ不飽和酮的結(jié)構(gòu)
　　問題1：查洱酮的變化？（E）
　　
　　問題2：二氫黃酮醇的變化？（D）
　　
　　問題3：黃酮醇的變化？（B）
　　問題4：二氫黃酮的變化？（C）
　　
　　問題5：黃酮的變化？（A）
　　
　　此外，尚有由兩分子黃酮或兩分子二氫黃酮，或一分子黃酮及一分子二氫黃酮按C—C或C-O-C鍵方式連接而成的雙黃酮類化合物。另有少數(shù)黃酮類化合物結(jié)構(gòu)很復(fù)雜，如水飛薊素為黃酮木脂體類化合物，而榕堿及異榕堿則為生物堿型黃酮。
　　
　　二、黃酮苷中糖的結(jié)構(gòu)與分類
　　天然黃酮類化合物多以苷類形式存在，并且由于糖的種類、數(shù)量、連接位置及連接方式不同，可以組成各種各樣的黃酮苷類。
　　除0-糖苷外，天然黃酮類化合物中還發(fā)現(xiàn)有C-苷，如葛根黃素、葛根黃素木糖苷，為中藥葛根中擴(kuò)張冠狀動脈血管的有效成分。

第二節(jié)　理化性質(zhì)
　　在黃酮類化合物的提取分離和結(jié)構(gòu)測定的研究方面，黃酮類化合物的理化性質(zhì)及其呈色反應(yīng)都發(fā)揮著譜學(xué)技術(shù)所替代不了的作用。下面僅就其與分離、結(jié)構(gòu)測定和鑒別密切相關(guān)的性質(zhì)進(jìn)行簡要介紹。
　　
　　一、性狀
　　黃酮類化合物多為結(jié)晶性固體，少數(shù)（如黃酮苷類）為無定形粉末。游離的苷元中，除二氫黃酮、二氫黃酮醇、黃烷及黃烷醇、二氫異黃酮有旋光性外，其余均無光學(xué)活性。黃酮苷類由于在結(jié)構(gòu)中引入了糖分子，故均有旋光性，且多為左旋。黃酮類化合物的顏色與分子中是否有交叉共軛體系及助色團(tuán)（-0H、-0CH₃等）的種類、數(shù)目、取代位置有關(guān)。以黃酮為例來說，其色原酮部分原本是無色的，但在2位上引入苯環(huán)后，即形成了交叉共軛體系，使共軛鏈延長，因而顯現(xiàn)出顏色。一般情況下，黃酮、黃酮醇及其苷類多顯灰黃至黃色，查耳酮為黃至橙黃色，而二氫黃酮、二氫黃酮醇、異黃酮類因不具有交叉共軛體系或共軛鏈較短，故不顯色（二氫黃酮及二氫黃酮醇）或顯淺黃色（異黃酮）。
　　特別指出的是，在上述黃酮、黃酮醇分子中，尤其是在7位及4’位引入-0H及-0CH₃等助色團(tuán)后，因有促進(jìn)電子移位、重排作用，而使化合物的顏色加深。如果-0H、-0CH₃引入其他位置，則影響較小。
　　花色素及其苷元的顏色隨pH不同而改變，一般顯紅（pH<7）、紫（pH=8.5）、藍(lán)（pH>8.5）等顏色。
　　
　　二、溶解性
　　黃酮類化合物的溶解度因結(jié)構(gòu)及存在狀態(tài)（苷或苷元、單糖苷、雙糖苷或三糖苷）不同而有很大差異。
　　一般游離苷元難溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有機(jī)溶劑及稀堿水溶液中。其中黃酮、黃酮醇、查耳酮等平面性強(qiáng)的分子，因分子與分子間排列緊密，分子間作用力較大，故更難溶于水；而二氫黃酮及二氫黃酮醇等，因系非平面性分子，分子與分子間排列不緊密，分子間作用力較小，有利于水分子進(jìn)入，故溶解度稍大。
　　至于花色苷元（花青素）類雖也為平面性結(jié)構(gòu)，但因以離子形式存在，具有鹽的通性，故親水性較強(qiáng)，在水中的溶解度較大。
　　黃酮類苷元分子中引入羥基，將增加在水中的溶解度；而羥基經(jīng)甲基化后，則增加在有機(jī)溶劑中的溶解度。例如，一般黃酮類化合物不溶于石油醚中，故可與脂溶性雜質(zhì)分開，但川陳皮素（5,6,7,8,3’,4’-六甲氧基黃酮）卻可溶于石油醚。
　　黃酮類化合物的羥基被糖苷化后，在水中溶解度則相應(yīng)增大，而在有機(jī)溶劑中的溶解度則相應(yīng)減小。黃酮苷一般易溶于水和甲醇、乙醇等極性有機(jī)溶劑中；但難溶或不溶于苯、氯仿等非極性有機(jī)溶劑中。一般情況下，苷的糖鏈越長，在水中的溶解度越大。
　　另外，糖的結(jié)合位置不同，對苷的水溶性也有一定影響。以棉黃素（3,5,7,8,3’,4’-六羥基黃酮）為例，其3-0-葡萄糖苷的水溶性大于7-0-葡萄糖苷。
　　
　　三、酸堿性
　?。ㄒ唬┧嵝?br />　　多數(shù)黃酮類化合物因分子中具有酚羥基，故顯酸性，可溶于堿性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺等有機(jī)溶劑中。
　　由于酚羥基數(shù)目及位置不同，酸性強(qiáng)弱也不同。以黃酮為例，其酚羥基酸性強(qiáng)弱順序依次為：
　　7,4’-二羥基>7或4’-羥基>-般酚羥基>5-羥基
　　此性質(zhì)可用于提取、分離及鑒別工作。例如C₇-0H因為處于C=0的對位，在P-π共軛效應(yīng)的影響下，酸性較強(qiáng)，可溶于碳酸鈉水溶液中，據(jù)此可用于鑒定工作。
　　例：在下列黃酮類化合物中，酸性最強(qiáng)的是（B）。
　　A.5-羥基黃酮
　　B.4’-羥基黃酮
　　C.3-羥基黃酮
　　D.4’-羥基二氫黃酮
　　E.3’-羥基黃酮
　　
　?。ǘA性
　　γ-吡喃酮環(huán)上的醚氧原子，因有未共用的電子對，故表現(xiàn)有微弱的堿性，可與強(qiáng)無機(jī)酸，如濃硫酸、濃鹽酸等生成鹽，但生成的鹽極不穩(wěn)定，遇水即可分解。

　　黃酮類化合物溶于濃硫酸中生成的鹽，常常表現(xiàn)出特殊的顏色，可用于鑒別。某些甲氧基黃酮溶于濃鹽酸中顯深黃色，且可與生物堿沉淀試劑生成沉淀。
　　
　　四、顯色反應(yīng)
　　黃酮類化合物的顯色反應(yīng)多與分子中的酚羥基及γ-吡喃酮環(huán)有關(guān)。
　?。ㄒ唬┻€原試驗
　　1.鹽酸-鎂粉（或鋅粉）反應(yīng)　它是鑒定黃酮類化合物最常用的顯色反應(yīng)。方法是將樣品溶于1.0ml甲醇或乙醇中，加入少許鎂粉（或鋅粉）振搖，滴加幾滴濃鹽酸，1～2分鐘內(nèi)（必要時微熱）即可顯色。多數(shù)黃酮、黃酮醇、二氫黃酮及二氫黃酮醇類化合物顯橙紅至紫紅色，少數(shù)顯紫至藍(lán)色，當(dāng)B-環(huán)上有-OH或-0CH₃取代時，呈現(xiàn)的顏色亦即隨之加深。但查耳酮、橙酮、兒茶素類則無該顯色反應(yīng)。異黃酮類化合物除少數(shù)例外，也不顯色。
　　由于花青素及部分橙酮、查耳酮等在濃鹽酸酸性下也會發(fā)生變色，故須預(yù)先作空白對照實驗（即在供試液中僅加入濃鹽酸進(jìn)行觀察）。
　　另外，在用植物粗提取液進(jìn)行預(yù)試驗時，為了避免提取液本身顏色的干擾，可注意觀察加入濃鹽酸后升起的泡沫顏色。如泡沫為紅色，即示陽性。
　　鹽酸-鎂粉反應(yīng)的機(jī)理過去解釋為由于生成了花色苷元所致，現(xiàn)在認(rèn)為是因為生成了陽碳離子的緣故。
　　2.四氫硼鈉（鉀）反應(yīng)　在黃酮類化合物中，NaBH₄對二氫黃酮類化合物專屬性較高，可與二氫黃酮類化合物反應(yīng)產(chǎn)生紅至紫色。其他黃酮類化合物均不顯色，可與之區(qū)別。方法是在試管中加入0.1ml含有樣品的乙醇液，再加等量2%NaBH₄的甲醇液，1分鐘后，加濃鹽酸或濃硫酸數(shù)滴，生成紫至紫紅色。
　　另外，近來報道二氫黃酮可與磷鉬酸試劑反應(yīng)而呈棕褐色，也可作為二氫黃酮類化合物的特征鑒別反應(yīng)。
　　（二）金屬鹽類試劑的絡(luò)合反應(yīng)
　　黃酮類化合物分子中常含有下列結(jié)構(gòu)單元（三羥基四羰基，四羰基五羥基，鄰二酚羥基），故?？膳c鋁鹽、鉛鹽、鋯鹽、鎂鹽等試劑反應(yīng)，生成有色絡(luò)合物。
　　1.鋁鹽　常用試劑為1%三氯化鋁或硝酸鋁溶液。生成的絡(luò)合物多為黃色（λ_max=415nm），并有熒光，可用于定性及定量分析。
　　2.鋯鹽　多用2%二氯氧化鋯甲醇溶液。黃酮類化合物分子中有游離的3-或5-羥基存在時，均可與該試劑反應(yīng)生成黃色的鋯絡(luò)合物。但兩種鋯絡(luò)合物對酸的穩(wěn)定性不同。3-羥基，4-酮基絡(luò)合物的穩(wěn)定性比5-羥基，4-酮基絡(luò)合物的穩(wěn)定性強(qiáng)（但二氫黃酮醇除外）。故當(dāng)反應(yīng)液中加入枸櫞酸后，5-羥基黃酮的黃色溶液顯著褪色，而3-羥基黃酮溶液仍呈鮮黃色（鋯-枸櫞酸反應(yīng)）。方法是取樣品0.5～1.0mg，用l0.0ml甲醇加熱溶解，加1.0ml2%二氯氧化鋯（ZrOCl₂）甲醇液，呈黃色后再加入2%枸櫞酸甲醇液，觀察顏色變化。
　　上述反應(yīng)也可在紙上進(jìn)行，得到的鋯鹽絡(luò)合物多呈黃綠色，并帶熒光。
　　3.鎂鹽　常用乙酸鎂甲醇溶液為顯色劑，本反應(yīng)可在紙上進(jìn)行。試驗時在濾紙上滴加一滴供試液，噴以乙酸鎂的甲醇溶液，加熱干燥，在紫外光燈下觀察。二氫黃酮、二氫黃酮醇類可顯天藍(lán)色熒光，若具有C₃-0H，色澤更為明顯。而黃酮、黃酮醇及異黃酮類等則顯黃至橙黃乃至褐色。
　　4.氯化鍶（SrCl₂）　在氨性甲醇溶液中，氯化鍶可與分子中具有鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物生成綠色至棕色乃至黑色沉淀。
　　試驗時，取約1.0mg檢品置小試管中，加入1.0ml甲醇使溶解（必要時可在水浴上加熱），加入3滴0.01mol/L氯化鍶的甲醇溶液，再加3滴已用氨蒸氣飽和的甲醇溶液，注意觀察有無沉淀生成。
　　5.三氯化鐵　三氯化鐵水溶液或醇溶液為常用的酚類顯色劑。多數(shù)黃酮類化合物因分子中含有酚羥基，故可產(chǎn)生陽性反應(yīng)，但一般僅在含有氫鍵締合的酚羥基時，才呈現(xiàn)明顯的顏色。
　?。ㄈ┡鹚犸@色反應(yīng)
　　當(dāng)黃酮類化合物分子中有下列結(jié)構(gòu)時，在無機(jī)酸或有機(jī)酸存在條件下，可與硼酸反應(yīng)，生成亮黃色。顯然，5-羥基黃酮及2’-羥基查耳酮類結(jié)構(gòu)可以滿足上述要求，故可與其他類型區(qū)別。一般在草酸存在下顯黃色并具有綠色熒光，但在枸櫞酸-丙酮存在的條件下，則只顯黃色而無熒光。
　　（四）堿性試劑顯色反應(yīng)
　　在日光及紫外光下，通過紙斑反應(yīng)，觀察樣品用堿性試劑處理后的顏色變化情況，對于鑒別黃酮類化合物有一定意義。其中，用氨蒸氣處理呈現(xiàn)的顏色置空氣中隨即褪去，但經(jīng)碳酸鈉水溶液處理而呈現(xiàn)的顏色置空氣中卻不褪色。
　　此外，利用堿性試劑的反應(yīng)還可幫助鑒別分子中某些結(jié)構(gòu)特征。例如：
　　1.二氫黃酮類易在堿液中開環(huán)，轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的異構(gòu)體——查耳酮類化合物，顯橙至黃色。
　　2.黃酮醇類在堿液中先呈黃色，通入空氣后變?yōu)樽厣?，?jù)此可與其他黃酮類區(qū)別。
　　3.黃酮類化合物的分子中有鄰二酚羥基取代或3,4’-二羥基取代時，在堿液中不穩(wěn)定，易被氧化，出現(xiàn)黃色→深紅色→綠棕色沉淀。

第三節(jié)　提取與分離
　　一、提取
　　黃酮類化合物的提取與分離可分別敘述如下：
　　黃酮苷類以及極性稍大的苷元（如羥基黃酮、雙黃酮、橙酮、查耳酮等），一般可用丙酮、乙酸乙酯、乙醇、水或某些極性較大的混合溶劑進(jìn)行提取。其中用得最多的是甲醇-水（1：1）或甲醇。一些多糖苷類則可以用沸水提取。在提取花青素類化合物時，可加入少量酸（如0.1%鹽酸）。但提取一般黃酮苷類成分時，則應(yīng)當(dāng)慎用，以免發(fā)生酸水解反應(yīng)。為了避免在提取過程中黃酮苷類發(fā)生水解，也可按常規(guī)提取苷的方法事先破壞酶的活性。大多數(shù)黃酮苷元宜用極性較小的溶劑，如用氯仿、乙醚、乙酸乙酯等提取，而對多甲氧基黃酮的游離苷元，甚至可用苯進(jìn)行提取。
　　對得到的粗提取物可進(jìn)行精制處理，常用的方法有：
　?。ㄒ唬┤軇┹腿》?br />　　根據(jù)黃酮類化合物極性的大小分別萃取。一般的黃酮苷元可以選擇氯仿或者乙醚進(jìn)行萃取，單糖苷可以選擇乙酸乙酯進(jìn)行萃取，多糖苷可以選擇水飽和的正丁醇來萃取。
　?。ǘA提取酸沉淀法
　　堿提取酸沉淀法對有酸性的游離的黃酮苷元都是合適的，因為游離的黃酮苷元具有親脂性，由于有酚羥基顯酸性，因此可以溶解在堿水中，當(dāng)用堿水提取后，再加入酸，能夠恢復(fù)為原來的游離的狀態(tài)，具有親脂性，在酸水中不溶解而形成沉淀。
　　黃酮苷類雖有一定極性，可溶于水，但卻難溶于酸性水，易溶于堿性水，故可用堿性水提取，再將堿水提取液調(diào)成酸性，黃酮苷類即可沉淀析出。此法簡便易行，如蘆丁、橙皮苷、黃芩苷的提取都采用了這個方法?，F(xiàn)以從槐米中提取蘆丁為例說明該法的操作過程?；泵祝ɑ睒銼o-phorajaponica L.的花蕾）加約6倍量水，煮沸，在攪拌下緩緩加入石灰乳至pH8～9，在此pH條件下微沸20～30分鐘，趁熱抽濾，殘渣再加4倍量的水煎煮一次，趁熱抽濾，合并濾液，在60℃～70℃的條件下，用濃鹽酸將合并濾液調(diào)至pH為5，攪勻后靜置24小時，抽濾，得沉淀物。用水將沉淀物洗至中性，60℃干燥得蘆丁粗品，用沸水重結(jié)晶，70℃～80℃干燥后得蘆丁純品。
　　在用堿酸法進(jìn)行提取純化時，應(yīng)當(dāng)注意所用堿液濃度不宜過高，以免在強(qiáng)堿性下，尤其加熱時破壞黃酮母核。在加酸酸化時，酸性也不宜過強(qiáng)，以免生成鹽，導(dǎo)致析出的黃酮類化合物又重新溶解，降低產(chǎn)品收率。當(dāng)藥材中含有大量果膠、黏液等水溶性雜質(zhì)時（如花、果類藥材），宜用石灰乳或石灰水代替其他堿性水溶液進(jìn)行提取，以使上述含羧基的雜質(zhì)生成鈣鹽沉淀，不被溶出。這將有利于黃酮類化合物的純化處理。
　?。ㄈ┨糠畚椒?br />　　主要適于黃酮苷類的精制，大部分黃酮苷類可用7%酚-水洗下。洗脫液經(jīng)減壓蒸發(fā)濃縮后，再用乙醚振搖除去殘留的酚，余下水層減壓濃縮即得較純的黃酮苷類成分。
　　
　　二、分離
　　現(xiàn)將較常用的分離方法介紹如下：
　?。ㄒ唬┲V法
　　分離黃酮類化合物常用的吸附劑或載體有硅膠、聚酰胺、葡聚糖凝膠及纖維素粉等。
　　1.硅膠柱色譜　此法應(yīng)用范圍最廣，按照黃酮類化合物極性的大小先后洗脫，達(dá)到分離的目的。主要適于分離異黃酮、二氫黃酮、二氫黃酮醇及高度甲基化（或乙醚化）的黃酮及黃酮醇類。
　　2.聚酰胺柱色譜　對分離黃酮類化合物來說，聚酰胺是較為理想的吸附劑。其吸附強(qiáng)度主要取決于黃酮類化合物分子中羥基的數(shù)目與位置及溶劑與黃酮類化合物或與聚酰胺之間形成氫鍵締合能力的大小。聚酰胺柱色譜可用于分離各種類型的黃酮類化合物，包括苷及苷元、查耳酮與二氫黃酮等。以Baptisialecontei為例，黃酮類化合物從聚酰胺柱上洗脫時有下述規(guī)律：
　?。?）苷元相同，洗脫先后順序一般是：叁糖苷，雙糖苷，單糖苷，苷元。
　?。?）母核上增加羥基，洗脫速度即相應(yīng)減慢。
　?。?）不同類型黃酮化合物，先后流出順序一般是：異黃酮，二氫黃酮醇，黃酮，黃酮醇。
　?。?）分子中芳香核、共軛雙鍵多者易被吸附，故查耳酮往往比相應(yīng)的二氫黃酮難于洗脫。
　　3.葡聚糖凝膠（Sephadexgel）柱色譜　對于黃酮類化合物的分離，主要用兩種型號的凝膠：Sephadex-G型及Sephadex-LH20型。用葡聚糖凝膠分離黃酮類化合物的機(jī)理是：
　　分離游離黃酮時，主要靠吸附作用。凝膠對黃酮類化合物的吸附程度取決于游離酚羥基的數(shù)目，數(shù)目越多，越難洗脫。但分離黃酮苷時，則分子篩的性質(zhì)起主導(dǎo)作用。在洗脫時，黃酮苷類大體上是按分子量由大到小的順序流出柱體。
　?。ǘ﹑H梯度萃取法
　　pH梯度萃取法適合于酸性強(qiáng)弱不同的黃酮苷元的分離。根據(jù)黃酮類苷元酚羥基數(shù)目及位置不同其酸性強(qiáng)弱也不同的性質(zhì)，可以將混合物溶于有機(jī)溶劑（如乙醚）后，依次用5%NaHC0₃、5% Na₂C0₃、0.2%NaOH及4%NaOH溶液萃取，來達(dá)到分離的目的。一般規(guī)律大致如下：7,4’-二羥基酸性最強(qiáng)，可以溶于5%NaHC0_3，其次是含有7或4’-羥基可以溶于5%Na₂C0₃，然后是含有-般酚羥基可以溶于0.2%NaOH溶液中，最后是含有5-羥基只能溶解在4% NaOH溶液中。
　?。ㄈ└鶕?jù)分子中某些特定官能團(tuán)進(jìn)行分離
　　在黃酮類成分的混合物中，具有鄰二酚羥基的成分與無此結(jié)構(gòu)的成分，性質(zhì)不同，可以進(jìn)行分離。
　　1.鉛鹽沉淀法。有鄰二酚羥基的成分可被乙酸鉛沉淀，不具有鄰二酚羥基的成分可被堿式乙酸鉛沉淀，據(jù)此可將兩類成分分離。與黃酮類成分混存的其他雜質(zhì)的分子中如有羧基（如樹膠、黏液、果膠、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、氨基酸等）或鄰二酚羥基（如鞣質(zhì)等）時，也可被乙酸鉛沉淀達(dá)到去雜質(zhì)的目的。
　　2.硼酸絡(luò)合法。具有鄰二酚羥基的黃酮可與硼酸絡(luò)合，生成物易溶于水，借此也可與不具上述結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物相互分離。
　　在實際工作中，常將上述色譜法與各種經(jīng)典方法相互配合應(yīng)用，以達(dá)到較好的分離效果。

第四節(jié)　鑒別與結(jié)構(gòu)測定
　　一、色譜法在黃酮類化合物鑒別中的應(yīng)用
　　1.紙色譜（PC）：適用于分離各種天然黃酮類化合物及其苷類的混合物。混合物的鑒定常采用雙向色譜法。以黃酮苷類為例來說，一般第一向展開采用某種醇性溶劑，如n.BuOH-HAc-H₂0（4：1：5上層，BAW），主要是根據(jù)分配作用原理進(jìn)行分離。第二向展開溶劑則用水或水溶液，如2%～6%HAc。主要是根據(jù)吸附作用原理進(jìn)行分離。
　　黃酮類化合物的苷元中，平面性較強(qiáng)的分子如黃酮、黃酮醇、查耳酮等，用含水類溶劑如3%～5%HAc展開時，幾乎停留在原點不動（R_f<0.02）；而非平面性分子如二氫黃酮、二氫黃酮醇、二氫查耳酮等，因親水性較強(qiáng)，故R_f值較大（0.10～0.30）。黃酮類化合物分子中羥基苷化后，極性即隨之增大，故在醇性展開劑中R_f值相應(yīng)降低，同一類型苷元，R_f值依次為：苷元>單糖苷>雙糖苷。以在BAW中展開為例，多數(shù)類型苷元（花色苷元例外）R_f值在0.70以上，而苷則小于0.70。但在用水或2%～8%HOAc，3%NaCl水溶液或1%HCl展開時，則上列順序?qū)嵉?，苷元幾乎停留在原點不動，苷類的R_f值可在0.5以上，糖鏈越長，則R_f值越大。
　　2.硅膠薄層色譜：用于分離與鑒定弱極性的黃酮類化合物較好。分離黃酮苷元常用的展開劑是甲苯-甲酸甲酯-甲酸（5：4：1），并可以根據(jù)待分離成分極性的大小適當(dāng)?shù)卣{(diào)整甲苯與甲酸的比例。
　　3.聚酰胺薄層色譜：適用范圍較廣，特別適合于分離含游離酚羥基的黃酮及其苷類。由于聚酰胺對黃酮類化合物吸附能力較強(qiáng)，因而需要用可以破壞其氫鍵締合的溶劑作為展開劑。在大多數(shù)展開劑中含有醇、酸或水。
　　
　　二、紫外及可見光譜在黃酮類化合物鑒別中的應(yīng)用
　　紫外及可見分光光度法是鑒定黃酮類化合物結(jié)構(gòu)的一種重要手段，一般程序如下：
　　1.測定樣品在甲醇溶液中的UV光譜。
　　2.測定樣品在甲醇溶液中加入各種診斷試劑后得到的UV及可見光譜。常用的診斷試劑有甲醇鈉（NaOMe）、乙酸鈉（NaOAc）、乙酸鈉-硼酸（NaOAc-H₃B0₃）、三氯化鋁（AlCl₃）及三氯化鋁-鹽酸（AlCl₃-HCl）等。
　　3.如樣品為苷類，則可先進(jìn)行水解，或甲基化后再水解，并測定苷元或其衍生物的UV光譜。各種診斷試劑的詳細(xì)配制方法及測定程序可參看有關(guān)文獻(xiàn)。
　　將上述各種光譜圖進(jìn)行對比分析，即可獲知有關(guān)結(jié)構(gòu)的重要信息。
　?。ㄒ唬S酮類化合物在甲醇溶液中的UV光譜特征
　　黃酮、黃酮醇等多數(shù)黃酮類化合物，因分子中存在如下所示的桂皮酰基及苯甲酰基組成的交叉共軛體系，故其甲醇溶液在200～400nm的區(qū)域內(nèi)存在兩個主要的紫外吸收帶，稱為峰帶I（300～400nm）及峰帶Ⅱ（220～280nm）。
　　1.黃酮及黃酮醇類　兩者UV光譜譜形相似，但帶I位置不同，可據(jù)此進(jìn)行分類：黃酮帶I<350nm，黃酮醇帶I〉350nm。
　　在黃酮及黃酮醇母核上，如7位及4’位引入羥基、甲氧基等供電基，將促進(jìn)結(jié)構(gòu)重排，有利于實現(xiàn)上述電子轉(zhuǎn)移，可引起相應(yīng)吸收帶向紅位移。通常，整個母核上氧取代程度越高，則帶I將越向長波方向位移。
　　2.查耳酮及橙酮類　共同特征是帶I很強(qiáng)，為主峰；而帶Ⅱ則較弱，為次強(qiáng)峰。
　　3.異黃酮、二氫黃酮及二氫黃酮醇　這三類化合物中，除有由A環(huán)苯甲酰系統(tǒng)引起的帶Ⅱ吸收（主峰）外，因B環(huán)不與吡喃酮環(huán)上的羰基共軛（或共軛很弱），故帶I很弱，常在主峰的長波方向處有一肩峰。
　　根據(jù)主峰的位置，可以區(qū)別異黃酮與二氫黃酮及二氫黃酮醇類。前者在245～270nm，后兩者在270～295nm。
　　（二）加入診斷試劑后引起的位移及其在結(jié)構(gòu)測定中的意義
　　1.加入診斷試劑后黃酮及黃酮醇類化合物的紫外光譜幾種主要的診斷試劑引起的位移及其結(jié)構(gòu)特征歸屬見表6-9。
　　表6-9　加入診斷試劑的黃酮及黃酮醇類化合物UV圖譜及結(jié)構(gòu)特征的歸屬

診斷試劑	帶Ⅱ	帶Ⅰ	歸屬
NaOMe		紅移40～60nm 強(qiáng)度不降	示有4’-OH
		紅移50～60nm 強(qiáng)度下降	示有3-OH，但無4’-OH
	吸收譜隨時間延長而衰退		示有對堿敏感的取代基，如3，4’-；3，3’，4’-；5’，6，7-；5，7，8-；3’，4’，5’-羥基取代等
NaOAc	紅移5～20nm		示有7-OH
		在長波一側(cè)有明顯肩峰	示有4’-OH，但無3-或7-OH
NaOAc/H3BO3		紅移12～30nm	示B環(huán)有鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)
	紅移5～10nm		示A環(huán)有鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)（但不包括5，6-位）
AlCl3及 AlCl3/HCl	AlCl3/HCl譜圖=AlCl3譜圖		示結(jié)構(gòu)中無鄰二酚羥基
	AlCl3/HCl譜圖≠AlCl3譜圖 峰帶Ⅰ紫移30～40nm 峰帶Ⅰ紫移50～65nm		示結(jié)構(gòu)中可能有鄰二酚羥基 示B環(huán)上有鄰二酚羥基 示A、B環(huán)上均可能有鄰二酚羥基
	AlCl3/HCl譜圖=MeOH譜圖		示無3-及/或5-OH
	AlCl3/HCl譜圖≠MeOH譜圖 峰帶Ⅰ紅移35～55 nm 峰帶Ⅰ紅移60nm 峰帶Ⅰ紅移50～60nm 峰帶Ⅰ紅移17～20nm		示可能有3-及/或5-OH 示只有5-OH 示只有3-OH 示可能同時有3-及5-OH 除5-OH外尚有6-含氧取代

　　
　　三、氫核磁共振在黃酮類化合物結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用
　　氫核磁共振（¹H-NMR）現(xiàn)在已經(jīng)成為黃酮類化合物結(jié)構(gòu)分析的一種重要方法。所用溶劑有氘代氯仿、氘代二甲基亞砜（DMS0-d₆）、氘代吡啶等，具體情況因溶解度而異。
　　沒有作成衍生物的黃酮類化合物常用無水DMS0-d₆作溶劑。它不僅溶解范圍廣，而且對于各種質(zhì)子信號的分辨率高，有利于鑒別黃酮類母核上的酚羥基，是一個十分理想的溶劑。例如在3,5,7-三羥基黃酮¹H-NMR譜上，羥基質(zhì)子信號將分別出現(xiàn)在δ12.40（5-OH）、10.93（7-OH）及9.70（3-OH）處。這些信號可因在樣品中加入重水而消失。
　　此外也可將黃酮類化合物作成三甲基硅醚衍生物，溶于四氯化碳中進(jìn)行測定。
　　歸納黃酮類化合物的質(zhì)子核磁共振譜，有以下一些重要規(guī)律：

　　（一）A環(huán)質(zhì)子
　　1.5,7-二羥基黃酮類化合物　其中，H-6及H-8將分別作為二重峰（J=2.5Hz），出現(xiàn)在δ5.70～6.90區(qū)域內(nèi)，且H-6信號總是比H-8信號位于較高的磁場區(qū)。當(dāng)7-OH成苷時，則H-6及H-8信號均向低磁場方向位移。
　　2.7-羥基黃酮類化合物　A環(huán)上有H-5、H-6、H-8三個芳香質(zhì)子。H-5因有C-4位羰基強(qiáng)烈的負(fù)屏蔽效應(yīng)的影響，以及H-6的鄰偶作用，將作為一個二重峰（J=Ca.9.0Hz）出現(xiàn)在δ8.0左右，位于比其他芳香質(zhì)子較低的磁場。H-6因有H-5鄰偶（J=Ca.9.0Hz）及H-8間偶（J=2.5Hz）的作用，將表現(xiàn)為一個雙二重峰。H-8因有H-6的間位偶合作用，故顯現(xiàn)為一個裂距較小的二重峰（J=2.5Hz）。
　　與5,7-二羥基黃酮類化合物比較，在7-羥基黃酮類化合物中H-6及H-8均將出現(xiàn)在較低的磁場內(nèi)，化學(xué)位移值大小的順序可能顛倒。
　?。ǘ〣環(huán)質(zhì)子
　　1.4’-氧取化黃酮類化合物
　　B環(huán)質(zhì)子分為H-3’，H-5’和H-2’，H-6’兩組，各以相當(dāng)于2個氫的雙峰信號（（J=8.5Hz）出現(xiàn)在δ6.5～7.9區(qū)域。H-3’，H-5’的化學(xué)位移總是比H-2’，H-6’的化學(xué)位移值小。
　　2.3’，4’-二氧取代黃酮類化合物
　　H-5’為d峰（J=8.5Hz），出現(xiàn)在δ6.70～7.10處。H-2’（d，J=2.5Hz）和H-6’（dd，J=8.5、2.5Hz），出現(xiàn)在δ7.20～7.90范圍。
　　3.3’，4’，5’-三氧取代黃酮類化合物
　　H-2’及H-6’將作為相當(dāng)于兩上質(zhì)子的一個單峰，出現(xiàn)在δ6.50～7.50范圍內(nèi)。
　　（三）C環(huán)質(zhì)子
　　1.黃酮醇類 因為C 環(huán)上沒有質(zhì)子，因此沒有特征峰。
　　2.黃酮類　該類化合物的H-3常常作為一個尖銳的單峰信號出現(xiàn)在δ6.30左右。因此，在5,6,7-或5,7,8-三含氧取代黃酮中，它將與A環(huán)的孤立芳?xì)洌℉-8或H-6）的單峰信號相混，應(yīng)當(dāng)注意區(qū)別。在8-甲氧基黃酮中，H-6因與8-OCH₃有遠(yuǎn)程偶合，致使信號變寬，峰強(qiáng)變?nèi)?，?jù)此可與H-3相區(qū)別。另外，當(dāng)對5-OH進(jìn)行選擇性氘代甲基硅烷化時，將會使H-6、H-8及H-3信號產(chǎn)生程度不等的位移：H-3至少向低場位移0.15化學(xué)位移單位，H-8則向高場位移0.15化學(xué)位移單位，但H-6基本上保持不變。至于三個信號之間的更大區(qū)別還可以通過其他核磁共振技術(shù)來得以實現(xiàn)。
　　3.異黃酮類　異黃酮上的H-2，因正好位于羰基的β位，且通過碳與氧相接，故將作為一個單峰出現(xiàn)在比一般芳香質(zhì)子較低的磁場區(qū)（δ7.60～7.80），當(dāng)用DMS0-d₆作溶劑時，還將進(jìn)一步移到δ8.50～8.70處。
　　4.二氫黃酮及二氫黃酮醇
　　（1）二氫黃酮　H-2與兩個磁不等同的H-3偶合（J_trans=Ca.11.0Hz；J_cis=Ca.5.0Hz），故作為一個雙二重峰出現(xiàn)，中心位于δ5.20處。兩個H-3，因有相互偕偶（J=17.0Hz）及H-2的鄰偶，將分別作為一個雙二重峰出現(xiàn)，中心位于δ2.80處，但兩組峰常有相互重疊現(xiàn)象。
　?。?）二氫黃酮醇　在天然存在的二氫黃酮醇中，H-2及H-3多為反式雙直立鍵，故分別作為一個二重峰出現(xiàn)（J=Ca.11.0Hz）。H-2位于δ4.90前后，H-3則位于δ4.30左右，兩者很容易區(qū)分，據(jù)此還可確定C-2及C-3的相對構(gòu)型，即兩質(zhì)子互為反式。
　?。ㄋ模┨巧系馁|(zhì)子
　?。ㄎ澹〤₆-CH₃及C₈-CH₃質(zhì)子
　?。┮阴Ｑ趸馁|(zhì)子
　?。ㄆ撸┘籽趸系馁|(zhì)子
　　除若干例外，甲氧基質(zhì)子信號一般在δ3.50～4.10處出現(xiàn)。
　　
　　四、碳核磁共振在黃酮類化合物結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用
　　黃酮類化合物¹³C-NMR信號的歸屬一般可以通過：①與簡單的模型化合物如苯乙酮、桂皮酸以及它們的衍生物的圖譜進(jìn)行比較；②用經(jīng)驗性的簡單芳香化合物的取代基位移加和規(guī)律進(jìn)行計算等方法加以解析。
　　但在比較復(fù)雜的系統(tǒng)中，信號化學(xué)位移的實測值與計算值有時差異較大。這時，對信號的指認(rèn)尚須借助于各種一維及二維NMR技術(shù)，詳細(xì)內(nèi)容可參見有關(guān)專著。
　　例：（B型題）
　　A.山奈酚
　　B.芹菜素
　　C.大豆素
　　D.二氫山奈酚
　　E.二氫芹菜素
　　問題1：¹H-NMR譜中母核質(zhì)子出現(xiàn)在最低場（化學(xué)位移7.82單峰）的是（C）
　　
　　問題2：¹H-NMR譜中母核質(zhì)子有三組四重峰，偶合常數(shù)分別為11Hz，5Hz，17Hz，該化合物是（E）
　　
　　問題3：¹H-NMR譜中母核質(zhì)子有一對雙重峰，偶合常數(shù)等于11Hz，該化合物是（D）
　　
　　問題4：¹H-NMR譜中可以見到6.49的單峰，該化合物是（B）
　　
　　問題5：¹H-NMR譜中沒有C環(huán)的質(zhì)子信號，該化合物是（A）
　　

第五節(jié)　含黃酮類化合物的中藥實例
　　一、黃芩
　　從中分離出來的黃酮類化合物有黃芩苷（含4.O%-5.2%）、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素。其中黃芩苷是主要有效成分，具有抗菌、消炎作用。此外，還有降轉(zhuǎn)氨酶的作用。黃芩苷的苷元是黃芩素，黃芩素的磷酸酯鈉鹽可用于治療過敏、喘息等疾病。
　　黃芩苷三個最主要的結(jié)構(gòu)特征：1.它是黃酮類化合物，三位是沒有羥基的，是一個黃酮類成分。2.在A環(huán)上有鄰二酚羥基取代。3.它是一個葡萄糖醛酸苷。
　　黃芩苷幾乎不溶于水，難溶于甲醇、乙醇、丙酮，可溶于熱乙酸。遇三氯化鐵顯綠色，遇乙酸鉛生成橙紅色沉淀。溶于堿及氨水，初顯黃色，不久則變?yōu)楹谧厣?。黃芩苷可用水煎煮加酸沉淀的辦法提取。
　　
　　二、葛根
　　葛根主要含異黃酮類化合物，主要成分有大豆素、大豆苷、葛根素。大豆素屬于苷元，大豆苷和葛根素都屬于苷。大豆苷和葛根素都屬于苷，大豆苷和葛根素的苷元是相同的，都是大豆素。大豆苷和葛根素雖然都是大豆素的苷，但所形成的苷是不一樣的。大豆苷是一個氧苷，而葛根素是一個碳苷。
　　葛根總異黃酮有增加冠狀動脈血流量及降低心肌耗氧量等作用。大豆素、大豆苷、葛根素他們既沒有三羥基也沒有五羥基，分子結(jié)構(gòu)中也沒有鄰二酚羥基，因此，在分離葛根總黃酮時就可以用氧化鋁柱色譜法分離。
　　
　　三、銀杏葉
　　銀杏葉中所含的黃酮結(jié)構(gòu)類型比較多，包括黃酮、黃酮醇及其苷類，也包括兒茶素類和雙黃酮類。其中最典型的是含有雙黃酮類化合物，銀杏葉中的黃酮類化合物有擴(kuò)張冠狀血管和增加腦血流量的作用。
　　
　　四、槐米
　　槐米里含有的有效成分是蘆丁。它的苷元是槲皮素，可用于治療毛細(xì)血管變脆引起的出血癥，并用作高血壓的輔助治療劑。
　　蘆丁和槲皮素是一組非常重要的黃酮類化合物。從結(jié)構(gòu)類型上講屬于黃酮醇類蘆丁分子中因含有鄰二酚羥基，性質(zhì)不太穩(wěn)定，暴露在空氣中能緩緩變?yōu)榘岛稚趬A性條件下更容易被氧化分解。蘆丁在水當(dāng)中的溶解度與溫度有很大關(guān)系，冷水里溶解度極差，而熱水里溶解度又很高，因此，在從槐米里提取蘆丁時主要就是利用了這一性質(zhì)選擇水煎或堿水提取的辦法。但在堿性條件下，蘆丁分子結(jié)構(gòu)中有因為有鄰二酚羥基很容易發(fā)生結(jié)構(gòu)的變化，所以在用堿水提取時要加少量的硼砂進(jìn)去，因為硼砂能達(dá)到保護(hù)鄰二酚羥基的目的。
　　
　　五、陳皮
　　陳皮的主要成分是橙皮苷，結(jié)構(gòu)類型屬于二氫黃酮，橙皮苷具有和蘆丁相同的用途。橙皮苷幾乎不溶于冷水，在乙醇或熱水中溶解度較大，可溶于吡啶、甘油和乙酸。在中藥陳皮里提取橙皮苷時也能選擇堿提酸沉的辦法。
　　
　　六、滿山紅
　　滿山紅中主要含有杜鵑素。從結(jié)構(gòu)類型上講杜鵑素也屬于二氫黃酮。杜鵑素是祛痰成分，臨床用于治療慢性支氣管炎。杜鵑素與鹽酸-鎂粉反應(yīng)呈粉紅色，加熱后變?yōu)槊倒寮t色，與FeCl₃反應(yīng)呈草綠色。等等。

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