愛華網(wǎng)微生物限度檢查是對生產(chǎn)單位所用的藥品原料、器具設(shè)備、工藝流程、生產(chǎn)環(huán)境和操作者的衛(wèi)生狀況進行衛(wèi)生評價的綜合依據(jù)。由于微生物限度檢查程序繁瑣，操作嚴格，檢查周期長，干擾因素多等原因都會造成檢驗結(jié)果誤差，這樣難以對生產(chǎn)做出系統(tǒng)、科學(xué)的管理?，F(xiàn)就微生物檢查時，容易引起誤差的幾個方面原因以及控制方法分析如下。
風(fēng)險一：檢驗方法
微生物限度/生物負載檢驗是對待測樣品中的微生物含量進行精確測定的實驗。其實驗方法分為培養(yǎng)基法和薄膜過濾法兩大類。
薄膜過濾技術(shù)是20世紀60年代以來發(fā)展起來的一項分離技術(shù)，它具有操作條件溫和、無污染、無相變等特點，在許多方面都得到應(yīng)用，如用于微生物檢測。薄膜過濾是通過使用一定孔徑的濾膜從液體中截留微生物，然后將其放在培養(yǎng)基上，使該微生物在膜表面成長為菌落，最后對其進行培養(yǎng)、計數(shù)、鑒定等。薄膜過濾方法不僅可用于飲料的微生物檢測，也可用于沖洗水、加工水、污水中的微生物檢測，是一種國際公認的微生物檢驗方法，得到了AOAC、美國、歐洲和日本等國家的藥典、FDA和EPA等組織的承認，廣泛應(yīng)用于制藥工業(yè)、食品及飲料工業(yè)、環(huán)境監(jiān)測、化妝品品質(zhì)控制和電子工業(yè)等領(lǐng)域。
與培養(yǎng)基法相比，薄膜過濾方法具有以下兩大優(yōu)點：
1.提供更準確的檢測結(jié)果：薄膜過濾法可以從大量的液體中富集少量的微生物，與傳統(tǒng)的檢測方法相比能夠提供更為精確的檢測結(jié)果，也可減少在檢測過程中取樣不均而導(dǎo)致的假陽性，檢測的靈敏度可達1CFU。
2. 可以通過沖洗去除抑制性物質(zhì)（如防腐劑），從而降低抑制劑對檢測結(jié)果的影響。
采用薄膜過濾法,濾膜孔徑應(yīng)不大于0.45um,直徑一般為50mm,若采用其他直徑的濾膜,沖洗量應(yīng)進行相應(yīng)的調(diào)整。選擇濾膜材質(zhì)時應(yīng)保證供試品及其溶劑不影響微生物充分被截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時,應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品,其濾膜和濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率,應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過濾后,若需要用沖洗液沖洗濾膜,每張濾膜每次沖洗量為100ml。總沖洗量不得超過1000ml,以避免濾膜上的微生物受損傷。
風(fēng)險二：取樣計劃
《GMP實施指南》中明確指出樣品應(yīng)具有代表性，應(yīng)能反映整批產(chǎn)品的情況和工藝情況。只有在對取樣方法和分析方法開展相關(guān)的驗證工作后，才能夠根據(jù)樣品的參數(shù)做放行決定或者進行工藝調(diào)整。
在允許范圍內(nèi)，取樣體積要盡可能大，因為大體積的樣品更能夠反映產(chǎn)品整體狀況。例如圖1對某藥廠的制藥用水進行監(jiān)測，縱坐標表示在取樣量為1L（淺藍色）和100ml（深藍色）時被檢測到的銅綠假單胞菌的數(shù)量，可以明顯觀察到取樣量為1L的樣品中的微生物計數(shù)要高于100ml，但是這個不是嚴格成比例的。增加取樣量能夠改善在低數(shù)量微生物計數(shù)時的不確定性，由此獲得更高的精確度和統(tǒng)計學(xué)意義上的計數(shù)。另外當取樣100ml時發(fā)現(xiàn)沒有微生物存在的情況下，取樣1L可明顯發(fā)現(xiàn)微生物的存在。因此對于低污染水平，100ml的取樣樣本非常明顯地增加了風(fēng)險：在和實際污染存在的情況下誤以為系統(tǒng)是干凈的。但是當我們將取樣體積提高到1L時這樣的風(fēng)險就被降低了：因為增加取樣體積改善了對整個水系統(tǒng)監(jiān)控的力度。
圖1：
另外參照美國藥典《1227》結(jié)果精密度分析，微生物技術(shù)結(jié)果的精密度與菌落的多少有直接關(guān)系，菌落數(shù)偏小的情況下會造成計數(shù)結(jié)果的誤差率過大，因此大的取樣體積相應(yīng)會增加結(jié)果的準確性。
風(fēng)險三：恢復(fù)生長率
薄膜過濾時，主要考慮兩個影響因素：
1、截留
樣品過濾時，微生物被截留在濾膜上，此時要關(guān)注捕獲微生物的能力。
2、恢復(fù)生長
培養(yǎng)基透過濾膜為微生物提供營養(yǎng)成分，使其繁殖生長成肉眼可見的菌落，此時要關(guān)注以下幾個因素：
1、被捕獲微生物的生長能力；
2、微生物必須能夠繁殖；
3、確保過濾基質(zhì)能夠使營養(yǎng)物質(zhì)通過；
4、要給微生物提供合適的營養(yǎng)成分，培養(yǎng)溫度和時間；
從圖2中可以看出：大孔徑的濾膜（0.8μm和1.2μm）允許一些小的微生物在較低挑戰(zhàn)級別下透過，但是對于0.45μm或者0.22μm孔徑的濾膜則不會有透過。
雖然0.22μm濾膜能夠截留挑戰(zhàn)微生物，但是在所有的測試體系中恢復(fù)生長率均小于0.45μm的濾膜。
對于大孔徑的濾膜（>0.7μm）透過率可能是造成恢復(fù)生長率低于其它小孔徑濾膜的原因。
大于0.45μm的濾膜能夠提高流速、透過性，偶爾也能夠增大菌落尺寸（方便計數(shù)）。然而，這些大尺寸濾膜也可能對某些微生物造成截留率的不足。因此，他們不適合菌落總數(shù)計數(shù)。但大孔徑的濾膜可以用于特定微生物的計數(shù)，如糞大腸菌群或者酵母菌。它們也可以用于難以過濾的樣品以提高透過性或者需要過濾大體積的樣品。這兩種情況下，都應(yīng)該對目標微生物的截留特性進行證明。
孔徑小于0.45μm的濾膜的缺點是降低了流速、透過性，當然也會降低恢復(fù)生長率。因此，通過我們的研究，0.2μm的濾膜并不適合用于對總需氧菌、酵母菌和霉菌的計數(shù)。
圖2：不同孔徑濾膜的恢復(fù)生長率
總的來說，微生物恢復(fù)生長率要關(guān)注的影響因素有：
1、微生物種類和狀態(tài)
2、孔徑
3、抑制性物質(zhì)
4、使用濾膜的結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分
5、生長用培養(yǎng)基
6、培養(yǎng)時間和溫度
風(fēng)險四：膜片的選擇
在膜過濾的檢測中，為了保證更好的檢測結(jié)果，應(yīng)根據(jù)檢測的情況選擇合適的濾膜。主要考慮的因素有孔徑、顏色、材質(zhì)、無菌性等。
孔徑：關(guān)系到微生物的截留效率、流速和恢復(fù)生長率，用于微生物檢測時，需要根據(jù)檢測的微生物指標來選擇合適孔徑的濾膜，如：
0.22μm：致病菌和某些驗證用菌種的捕獲
0.45μm：普通細菌的截留和培養(yǎng)
0.7μm：糞大腸菌群的截留和培養(yǎng)
0.8μm：酵母菌和霉菌的截留和培養(yǎng)
1.2μm：難過濾樣品中霉菌和酵母菌的截留和培養(yǎng)
通常建議使用 0.45µm濾膜，因為 0.45µm能夠提供較好的截留率，更好的流速和廣譜微生物穩(wěn)定的恢復(fù)生長率。
顏色：為了增加計數(shù)時的本底對比度，根據(jù)菌落顏色的不同，需要選擇不同顏色的濾膜，當菌落的顏色為白色、透明或蒼白色時，可選擇綠色或黑色的濾膜；當菌落在生長的過程中會有色素產(chǎn)生時，可選擇白色的濾膜。
材質(zhì)：從化學(xué)兼容性和抑菌性殘留的角度進行考慮，微生物實驗?zāi)て牟馁|(zhì)主要有兩種：MCE(混合纖維素)和PVDF(聚偏二氟乙烯)。由于化學(xué)兼容性的不同：中性的樣品（如水等）選用MCE膜片即可；而對于強酸（如1N鹽酸）或強堿（如3N氫氧化鈉）則應(yīng)使用PVDF膜片。另外，PVDF材質(zhì)膜片的吸附性更低，因此更適于含抑菌性物質(zhì)的樣品（如抗生素）的檢測。
無菌性，目前主要分無菌濾膜和可滅菌濾膜兩種，一般按照我們使用的濾器進行選擇，為了保證滅菌過程不會破壞濾膜的完整性，應(yīng)該選用出廠前即完成滅菌的濾膜。中國藥典除了對微生物實驗中使用的濾膜孔徑進行規(guī)定之外，還提到“濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性?！?，但是實際在自行高溫高壓滅菌的同時，對濾膜本身是有一定的損害的，用戶無法自行完成完整性的測試工作，因此建議使用廠家COA進行質(zhì)量保證的無菌濾膜。
網(wǎng)格：為了便于計數(shù)，選用帶網(wǎng)格的點狀膜，既不影響觀察菌落形態(tài)，又便于觀察計數(shù)。濾膜上的網(wǎng)格由細小的點組成，使用特殊的油墨（對微生物無毒性）印刷到濾膜表面，這樣截留在附近的微生物就能夠跨越網(wǎng)格進行生長而不受網(wǎng)格的影響。
風(fēng)險五：過濾硬件設(shè)備的選擇
在微生物檢測實驗中，實驗結(jié)果容易受到設(shè)備、環(huán)境和人員操作的影響產(chǎn)生假陽性。為了避免假陽性的風(fēng)險，對于環(huán)境、人員以及設(shè)備都有嚴格的要求。
環(huán)境：微生物限度檢查的全過程，均應(yīng)遵守無菌操作，嚴防再污染，因此要求在受控潔凈環(huán)境下的局部潔凈度不低于B級單向流空氣區(qū)域內(nèi)進行，限度檢查實驗室應(yīng)配有相應(yīng)的人流和物流緩沖間，并定期作環(huán)境監(jiān)測。
人員：所有人員在上崗前要接受必須的GMP培訓(xùn)、無菌操作技術(shù)、設(shè)備操作、更衣培訓(xùn)、微生物檢驗技術(shù)和試驗室生物安全等方面的培訓(xùn)，經(jīng)考核合格后方可上崗。檢驗人員必須熟悉相關(guān)監(jiān)測方法、程序、檢驗?zāi)康暮徒Y(jié)果評價。
設(shè)備：選擇的硬件設(shè)備一定要具備以下特性：
1、操作簡單，設(shè)備易于維護，過濾速度快
2、能保證足夠的真空度，符合ISO8199的要求；
3、應(yīng)便于濾膜的取置；
4、抽濾管路易于清潔，不會反向污染濾膜；
5、適用于層流臺或者安全柜（真空泵應(yīng)放在層流區(qū)域外，或者使用內(nèi)置隔膜泵）；
6、接觸濾膜的支座易于清潔和滅菌，避免有死角；
7、經(jīng)過恰當?shù)尿炞C；
8、濾杯應(yīng)易于清潔和滅菌，易于讀取體積，便于疊放
