拉曼光譜法是研究化合物分子受光照射后所產(chǎn)生的散射，散射光與入射光能級差和化合物振動頻率、轉(zhuǎn)動頻率的關(guān)系的分析方法。

與紅外光譜類似，拉曼光譜是一種振動光譜技術(shù)。所不同的是，前者與分子振動時偶極矩變化相關(guān)，而拉曼效應(yīng)則是分子極化率改變的結(jié)果，被測量的是非彈性的散射輻射。

拉曼光譜通常采用激光作為單色光源，將樣品分子激發(fā)到某一虛態(tài)，隨后受激分子弛豫躍遷到一個與基態(tài)不同的振動能級，此時，散射輻射的頻率將與入射頻率不同。這種頻率變化與基態(tài)和終態(tài)的振動能級差相當。這種“非彈性散射”光就稱之為拉曼散射。頻率不變的散射稱為彈性散射，即所謂瑞利散射。如果產(chǎn)生的拉曼散射頻率低于入射頻率，則稱之為斯托克散射。反之，則稱之為反斯托克散射。實際上，幾乎所有的拉曼分析都是測量斯托克散射。

拉曼光譜與紅外吸收光譜相似。用散射強度對拉曼位移作圖。拉曼位移（以cm^-1為單位）等于激發(fā)光的波數(shù)減去散射輻射的波數(shù)。由于功能團或化學鍵的拉曼位移與它們在紅外光譜中的吸收波數(shù)相一致，所以譜圖的解析也與紅外吸收光譜相同。然而，通常在拉曼光譜中出現(xiàn)的強譜帶在紅外光譜中卻成為弱譜帶甚至不出現(xiàn)，反之亦然。所以，這兩種光譜技術(shù)?；檠a充。

拉曼光譜的優(yōu)點在于它的快速，準確，測量時通常不破壞樣品（固體，半固體，液體或氣體），樣品制備簡單甚至不需樣品制備。譜帶信號通常處在可見或近紅外光范圍，可以有效地和光纖聯(lián)用。這也意味著譜帶信號可以從包封在任何對激光透明的介質(zhì)，如玻璃，塑料內(nèi)，或?qū)悠啡苡谒蝎@得。現(xiàn)代拉曼光譜儀使用簡單，分析速度快（幾秒到幾分鐘），性能可靠。因此，拉曼光譜與其他分析技術(shù)聯(lián)用比其他光譜聯(lián)用技術(shù)從某種意義上說更加簡便（可以使用單變量和多變量方法以及校準）。

除常規(guī)的拉曼光譜外，還有一些較為特殊的拉曼技術(shù)。它們是共振拉曼，表面增強拉曼光譜，拉曼旋光，相關(guān)-反斯托克拉曼光譜，拉曼增益或減失光譜以及超拉曼光譜等。其中，在藥物分析應(yīng)用相對較多的是共振拉曼和表面增強拉曼光譜法。

⑴共振拉曼光譜法

當激光頻率接近或等于分子的電子躍遷頻率時，可引起強列的吸收或共振，導致分子的某些拉曼譜帶強度急劇增強數(shù)百萬倍，這就是共振拉曼效應(yīng)。

許多藥物在紫外-可見光區(qū)有強的電子躍遷。某些含發(fā)色團化合物的拉曼光譜因共振而增強，而其基體物質(zhì)的光譜卻不會增強。共振拉曼技術(shù)與常規(guī)拉曼光譜技術(shù)不同之處在于要求光源可變，可調(diào)諧染料激光器是獲得共振拉曼光譜的必要條件。

有些化合物可通過化學反應(yīng)改變其結(jié)構(gòu)，使之最大吸收峰接近激發(fā)光頻率，如生成有色化合物，然后再進行共振拉曼光譜測定也是一個提高靈敏度的較有效的方法。

共振拉曼技術(shù)由于靈敏度高而特別適用于藥物和生物大分子的研究。但伴隨樣品本身或由雜質(zhì)引起的熒光，以及為這一特殊光譜所需的激光和光學設(shè)計費用，限制了共振拉曼光譜的應(yīng)用。

⑵表面增強拉曼光譜法（ SERS）

吸附在極微小金屬顆粒表面或其附近的化合物（或離子）的拉曼散射要比該化合物的正常拉曼散射增加10³～10⁶倍。這種表面增強拉曼散射(SERS)在銀表面上最強，在金或銅的表面上也可觀察到。

SERS現(xiàn)象主要由金屬表面基質(zhì)受激而使局部電磁場增強所引起。效應(yīng)的強弱取決于與光波長相對應(yīng)的表面粗糙度大小，以及和波長相關(guān)的復雜的金屬電介質(zhì)作用的程度。許多SERS基質(zhì)可以用于藥物分析，最常用的包括溶膠，電極，電介質(zhì)表面金屬膜等。

帶孤對電子或 π電子云的分子呈現(xiàn)的 SERS效應(yīng)最強，其他芳氮或含氧化合物，如芳胺和酚，也具有強的SERS活性，這一效應(yīng)在其他電負性功能團如羧酸中也能觀察到。

從少數(shù)分子獲得大量結(jié)構(gòu)信息的可能性使得 SERS可用于解決高靈敏度化

學分析的許多問題。在表面增強拉曼光譜中，熒光的干擾可有效地得到抑制。定性和含量測定1、定性鑒別拉曼光譜可提供有關(guān)樣品分子中存在何種功能團的結(jié)構(gòu)信息。所以可用于鑒

別試驗和結(jié)構(gòu)解析。在相同的測定條件下，繪制供試品與對照品的拉曼光譜進

行比對，若兩光譜相同，即鑒別為同一化合物。如遇多晶現(xiàn)象，可參照紅外鑒別

的相關(guān)內(nèi)容進行處理。

2、含量測定

拉曼譜帶的強度與待測物濃度的關(guān)系遵守比爾定律：

IV = KLCI 0其中IV是給定波長處的峰強，K代表儀器和樣品的參數(shù)，L是光路長度，C是樣品中特定組分的摩爾濃度，I0是激光強度。實際工作中，光路長度被更準確的描述為樣品體積，這是一種描述激光聚焦和采集光學的儀器變量。上述等式是拉曼定量應(yīng)用的基礎(chǔ)。

3、影響定量測定的因素

最主要的干擾因素是熒光、樣品的熱效應(yīng)和基質(zhì)或樣品自身的吸收。在拉曼光譜中，熒光干擾表現(xiàn)為一個典型的傾斜寬背景。因此，熒光對定量的影響主要為基線的偏離和信噪比下降，熒光的波長和強度取決于熒光物質(zhì)的種類和濃度。與拉曼散射相比，熒光通常是一種量子效率更高的過程，甚至很少量不純物質(zhì)的熒光也可以導致顯著的拉曼信號降低。使用更長的波長例如785nm或 1064nm的激發(fā)光可使熒光顯著減弱。然而，拉曼信號的強度與λ^-4成比例，λ是激發(fā)波長。通過平衡熒光干擾、信號強度和檢測器響應(yīng)可獲得最佳信噪比。

測量前將樣品用激光照射一定時間，固態(tài)物質(zhì)的熒光也可得以減弱。這個過程被稱為光致漂白，是通過降解高吸收物質(zhì)來實現(xiàn)的。光致漂白作用在液體中并不明顯，可能是由于液體樣品流動性，或熒光物質(zhì)不是痕量。

樣品加熱會造成一系列的問題，例如物理狀態(tài)的改變（熔化），晶型的轉(zhuǎn)變或樣品的燒灼。這是有色的、具強吸收或低熱傳導的小顆粒物質(zhì)常出現(xiàn)的問題。樣品加熱的影響通常是可觀察的，表現(xiàn)在一定時間內(nèi)拉曼光譜或樣品的表觀變化。除了減少激光通量，有許多種方法可用來降低熱效應(yīng)，例如在測量過程中移動樣品或激光，或者通過熱接觸或液體浸入來改善樣品的熱傳導。

基質(zhì)或樣品本身也可吸收拉曼信號。在長波傅里葉變換拉曼系統(tǒng)中，拉曼信號可以與近紅外的泛頻吸收重疊。這種影響與系統(tǒng)的光學以及樣品的形態(tài)有關(guān)。裝填和顆粒大小的差異而引起的固體散射的可變性與這種效應(yīng)有關(guān)。然而，由于

在拉曼光譜中樣品的有限穿透深度和相對狹窄的波長范圍，所有這些效應(yīng)的大小

都沒有近紅外光譜嚴重。

定量拉曼光譜與許多其它的光譜技術(shù)不同，它是單光束零背景測量。謹慎地進行樣品測定以及使用設(shè)計合理的儀器可以使這種變異減到最小，但是并不能全部消除。所以，絕對的拉曼信號強度很難直接用于待測物的定量。變異的潛在來源是樣品的不透明性和樣品的不均勻性、照射樣品的激光功率的變化以及光學幾何學或樣品位置的變化。這些影響可以通過能重復的或有代表性的樣品處置方式予以減小。

由于拉曼信號絕對強度的波動，使用內(nèi)標是最普通和有效的減少可變性的方法。內(nèi)標方法有幾種變通選擇?？梢杂心康牡丶尤胍环N內(nèi)標，該內(nèi)標應(yīng)具有與待測物互不干擾的獨特譜帶以便檢測。在溶液中，也可利用溶劑的獨特譜帶，因為溶劑隨樣品不同將相對保持不變。另外，在制劑中，如果賦形劑量大大超過待測組分，則可以使用該賦形劑的峰。在假設(shè)激光和樣品定位的改變將會同等地影響全光譜的前提下，全光譜同樣可以用作參比。

樣品測定中需考慮的重要因素還有光譜的污染。拉曼是一種可以被許多外源影響掩蔽的弱效應(yīng)。普通的污染源包括樣品支持物（容器或基質(zhì)）和周圍光線。通常，這些問題可以通過細致的實驗方法來識別和解決。

儀器裝置

根據(jù)獲得光譜的方式，拉曼光譜儀可分為FT拉曼光譜儀和色散型拉曼光譜儀，但所有的現(xiàn)代拉曼光譜儀均包括激光光源、樣品裝置、濾光器、單色器（或干涉儀）和檢測器等組成。

⑴激光光源

表 1列出幾種在藥學應(yīng)用中經(jīng)常使用的激光。紫外激光有時也有特殊應(yīng)用，但是由于種種原因在常規(guī)分析中很少采用。

表 1：藥學應(yīng)用中的主要激光

⑵樣品裝置

可有各種各樣的樣品放置方式，包括直接的光學界面，顯微鏡，光纖維探針（不接觸或光學浸入）和樣品室（包括特殊的樣品盛器和自動樣品轉(zhuǎn)換器）。樣品光路也可被設(shè)計成能獲得偏振相關(guān)拉曼光譜，這種光譜通常包含附加信息。樣品裝置的選擇應(yīng)根據(jù)待測物的具體情況（如樣品的狀態(tài)、體積等）以及測量的速度，激光的安全性和樣品圖譜的質(zhì)量要求等決定。

⑶濾光裝置

激光波長的散射光（瑞利光）要比拉曼信號強幾個數(shù)量級，必須在進入檢測器前濾除。陷波濾波器幾乎被普遍應(yīng)用于這個目的，它具有濾波效果好和體積小等優(yōu)點。另外，為防止樣品不被外輻射源（例如：房間的燈光，激光等離子體）照射，需要設(shè)置適宜的濾波器或者物理屏障。

⑷光波處理裝置

光波信號可通過色散或者干涉（傅里葉變換）來處理。任何合格儀器都適用于定性鑒別。然而，選擇定量測定用儀器時，應(yīng)注意色散和線性響應(yīng)可能在整個波譜范圍內(nèi)并不均衡（例如當使用階梯光柵分光鏡時）。

⑸檢測器

硅質(zhì) CCD是色散儀器中最常用的檢測器。這種冷卻的陣列檢測器允許在低噪聲下的快速全光譜掃描。常與通常使用的785納米二極管激光器配合使用。傅里葉變換儀器通常采用單通道鍺或銦－鎵－砷化合物(InGaAs)檢測器以配合釹：

釔－鋁－石榴紅(Nd:YAG)1064納米的激光器在近紅區(qū)使用。

儀器校正

拉曼儀器的校準包括三個要素：初始波長（ X軸）,激光波長以及強度（Y軸）。

儀器供應(yīng)商應(yīng)該提供一種由用戶可以執(zhí)行的，對儀器相關(guān)參數(shù)校準的方法，除另有規(guī)定外，使用者應(yīng)根據(jù)儀器所提供的校準方法制定具體的SOP，并嚴格按照 SOP對上述參數(shù)進行驗證。

特別需要注意到，激光波長變化可影響儀器的波長精度和光度（強度）精度。即使是最穩(wěn)定的激光器在使用過程中，其輸出波長也會有輕微變化。所以，激光波長必須被校正以確保拉曼位移的準確性?？梢允褂脙x器公司提供的拉曼位移標準參考物質(zhì)進行定期校正。某些儀器可以用一種拉曼內(nèi)標物與初級光路分離，外在校準裝置通過散射輻射準確地重現(xiàn)這一光路。

推薦使用外部參考標準對儀器進行校正。

方法驗證

對拉曼方法進行驗證是必須的，至少應(yīng)考察準確度，精密度等主要指標，然而，這些指標受諸多可變因素的影響，其中熒光可能是影響方法適用性的主要變量。樣品中熒光雜質(zhì)的存在完全隨樣品而異。所以，方法必須能適應(yīng)不同樣品體系，必須足以將雜質(zhì)的影響降到最小。

檢測器的線性必須適應(yīng)可能的信號水平范圍。熒光可能使信號基線比驗證時高，這時必須設(shè)法將熒光減弱或者使驗證的方法適應(yīng)較高的熒光水平。這一要求對方法的精密度，檢測限（LOD）和定量限（LOQ）同樣適用，因為基線噪聲的增加會對這些數(shù)值產(chǎn)生影響。

由于熒光使基線漂移可能同樣會影響定量，所以使用時，同樣需要在不同的光漂白作用水平進行可接受的定量驗證。

必須確定激光是否對樣品造成影響。在不同激光功率和暴露時間的條件下，對樣品目視檢查和仔細審視測得的拉曼光譜測量可以確定樣品是否改變（而不是光漂白作用）。觀察到依據(jù)是譜帶的位置、峰強和譜帶寬度是否改變或者背景強度是否有明顯的變化。

影響方法精密度的因素還包括樣品的位置。樣品的形態(tài)對于固體或液體都是

非常重要的因素，在校正模型中必須嚴密控制或說明。樣品的制備方法或樣品試

架的形狀可能影響測量靈敏度，而且，該靈敏度會隨著儀器的激發(fā)光和采集光學

設(shè)置的不同而不同。

測定法

獲得拉曼光譜可以采用下述任一物質(zhì)態(tài)：結(jié)晶態(tài)、無定型、液體、氣體或等離子體。

液體能夠在玻璃管或石英管中直接測量。無定型和微晶固體也可充填入玻璃管或石英管中直接測定。為了獲得較大的拉曼散射光強度，通常使照射在樣品上的入射光與所檢測的拉曼散射光之間的夾角為0º，90º和 180º。樣品池的放置可有多種方式。

除另有規(guī)定外，一般用作鑒別的樣品不必制樣，用作晶型、異構(gòu)體限度檢查或含量測定時，供試品的制備和具體測定方法可按正文中各品種項下有關(guān)規(guī)定操作。

某些特殊樣品技術(shù)可被應(yīng)用于表面增強拉曼光譜和顯微拉曼光譜測量。

為防止樣品分解常采用的一種辦法是旋轉(zhuǎn)技術(shù)，利用特殊的裝置使激光光束的焦點和樣品的表面做相對運動，從而避免了樣品的局部過熱現(xiàn)象。樣品旋轉(zhuǎn)技術(shù)除能防止樣品分解外，還能提高分析的靈敏度。

常采用內(nèi)標法定量，在激光照射下，加入的內(nèi)標也產(chǎn)生拉曼光譜，選擇其一條拉曼譜帶作為標準，將樣品的拉曼譜帶強度與內(nèi)標譜帶的強度進行比較(通常比較譜帶的面積或高度)。由于內(nèi)標和樣品完全處于相同的實驗條件下，一些影響因素可以相互抵消。

所選擇的內(nèi)標應(yīng)滿足以下要求：

①化學性質(zhì)比較穩(wěn)定，不與樣品中被測成分或其它成分發(fā)生化學反應(yīng)，②內(nèi)標拉曼譜帶和待測物的拉曼譜帶互不干擾，③內(nèi)標應(yīng)比較純，不含有被測成分或其他干擾成分。對于非水溶液，常用的內(nèi)標為四氯化碳(459cm^-1)；而對于水溶液，常用的內(nèi)標是硝酸根離子(1050cm^-1)和高氯酸根離子。對于固體樣品，有時選擇樣品中某一拉曼譜帶作為自身對照內(nèi)標譜帶。

具有多晶現(xiàn)象的固體藥品，由于晶型的不同，可能導致所收集供試品的光譜

圖與對照品光譜圖或與標準光譜集所收載的光譜圖不一致，遇此情況，應(yīng)按該品種項下規(guī)定的方法進行預(yù)處理后再繪制比對。光譜的形狀與所用的儀器型號和性能、激發(fā)波長、樣品測定狀態(tài)、及吸水程度等因素相關(guān)。因此，進行光譜比對時，應(yīng)考慮各種因素可能造成的影響。