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0引言由于保加利亞乳桿菌（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）與嗜熱鏈球菌（Streptococcusthermophilus）之間存在互惠共生作用，使其在乳品工業(yè)中得到了廣泛的運用[1]。通常利用這兩種乳酸菌混合發(fā)酵會提高產(chǎn)酸速度，減弱后酸化程度，促進風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生[2]，產(chǎn)生更多的胞外多糖，所以傳統(tǒng)上常采用二者混合發(fā)酵制作酸奶。伴隨分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，人們開始從微觀的角度去研究保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌的共生機制。2001年，完成了第一株乳酸菌（Lactococcuslactisssp. lactisIL1403）的全基因序列測序工作[3]。迄今為止，已經(jīng)公布了至少7株保加利亞乳桿菌和14株嗜熱鏈球菌的全序列基因組，其中包括本實驗室于2010年完成測序的保加利亞乳桿菌ND02與嗜熱鏈球菌ND03。這為我們從分子水平上去全面了解乳酸菌的共生機制奠定了基礎(chǔ)。1 共生過程中菌株的生長變化通常情況下，保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌的相互作用表現(xiàn)為互惠共生。它們在乳中發(fā)酵時，從開始接菌到發(fā)酵結(jié)束其過程一般可分為3個階段，即發(fā)酵前期、發(fā)酵中期、發(fā)酵后期。發(fā)酵前期：嗜熱鏈球菌進入對數(shù)生長期，而保加利亞乳桿菌的生長受到抑制，此時，嗜熱鏈球菌是主要的產(chǎn)酸菌株[1]。發(fā)酵中期：嗜熱鏈球菌的生長進入了穩(wěn)定期，而伴隨著pH值的下降保加利亞乳桿菌生長開始進入對數(shù)生長期。發(fā)酵后期：保加利亞乳桿菌的生長進入穩(wěn)定期，嗜熱鏈球菌開始“二次生長”[4]。這一現(xiàn)象與我們所做的保加利亞乳桿菌ND02與嗜熱鏈球菌ND03的共生試驗結(jié)果相一致。在2.5h到3.5 h發(fā)酵過程中，ND03活菌數(shù)維持在8.6 mL-1(對數(shù)值)，當(dāng)保加利亞乳桿菌ND02進入穩(wěn)定期后， 嗜熱鏈球菌出現(xiàn)了二次生長現(xiàn)象使得其活菌數(shù)達到9.5mL-1（對數(shù)值）。一些科學(xué)家認(rèn)為引起該現(xiàn)象的原因是由于細(xì)胞壁蛋白水解酶PrtB在促進嗜熱鏈球菌的“二次生長”中起了重要作用[5]。值得注意的是，由于菌體的個體差異，在實驗過程中我們偶爾也會發(fā)現(xiàn)兩種菌在生長過程中表現(xiàn)為中性甚至抑制相互生長的現(xiàn)象。因此，并非所有的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌都能互惠共生。近幾年，許多試驗證明即使表現(xiàn)為共生的菌株，在某些機制上也同樣存在著競爭現(xiàn)象。從多方面考慮，保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌的混合發(fā)酵更有利于嗜熱鏈球菌菌株的生長。第一，保加利亞乳桿菌比嗜熱鏈球菌有更高的營養(yǎng)需求，尤其是對氨基酸和甲酸的需求，這使得初期階段嗜熱鏈球菌較保加利亞乳桿菌生長快，使嗜熱鏈球菌在爭奪乳中有限營養(yǎng)物質(zhì)上占據(jù)了優(yōu)勢[4]。第二，混合發(fā)酵溫度一般為42℃，與保加利亞乳桿菌的最適生長溫度（45~50℃）相比更接近嗜熱鏈球菌的最適生長溫度（40~45℃），從而更加有利于嗜熱鏈球菌的生長。2 共生過程中菌株的主要生理變化目前，眾多研究者采用基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)相結(jié)合的方法研究保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌在乳中混合發(fā)酵過程中的生理變化。他們的研究發(fā)現(xiàn)，與單菌培養(yǎng)相比較，主要有以下幾個方面的變化：肽類、氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白以及某些氨基酸生物合成途徑的變化，與核苷酸堿基代謝，氧化性應(yīng)激以及糖代謝相關(guān)的基因以及蛋白質(zhì)類物質(zhì)的變化。2.1 蛋白質(zhì)代謝由于牛乳中游離氨基酸的含量較低，從而限制了乳酸菌的生長，因此嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌必須將酪蛋白降解為肽類和氨基酸，以滿足其對含氮類物質(zhì)的需求。傳統(tǒng)上，我們認(rèn)為雖不同的保加利亞乳桿菌水解蛋白能力具有一定的差異，但總體上其水解能力要高于嗜熱鏈球菌。保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌蛋白水解能力的差異主要是由它們含有的不同酶類造成的。研究發(fā)現(xiàn)，保加利亞乳桿菌中含有一種可以降解酪蛋白的細(xì)胞壁蛋白水解酶PrtB，而只有很少一部分嗜熱鏈球菌含有和PrtB具有同源性的胞外蛋白水解酶PrtS[5]。更為值得注意的是，在PrtB存在的情況下，PrtS對嗜熱鏈球菌生長的促進作用表現(xiàn)的并不明顯。1990年，Rajagopal等通過測定酪氨酸的釋放情況，對保加利亞乳桿菌的蛋白水解能力進行了較為全面的評估[9]。研究表明，保加利亞乳桿菌可以產(chǎn)生除天門冬酰胺、谷氨酸、半胱氨酸外的所有氨基酸。其中，脯氨酸、賴氨酸、纈氨酸占總氨基酸產(chǎn)量的42%~43%。大多數(shù)嗜熱鏈球菌的生長都需要蛋氨酸、組氨酸、脯氨酸以及谷氨酸[7]，而前3種物質(zhì)則主要是由保加利亞乳桿菌提供的。由于多數(shù)保加利亞乳桿菌無法合成谷氨酸，而酪蛋白和許多的肽類物質(zhì)都含有豐富的谷氨酸，因此谷氨酸很可能是以肽類的形式提供的。以前，人們認(rèn)為保加利亞乳桿菌可以為嗜熱鏈球菌提供生長需要的全部氨基酸和肽類物質(zhì)。然而，有研究發(fā)現(xiàn)在兩種菌株混合培養(yǎng)時，嗜熱鏈球菌的含硫氨基酸合成途徑仍然是開通的，但是其濃度與其它氨基酸相比較反而降低。這說明嗜熱鏈球菌生長所需的某些氨基酸或肽類物質(zhì)有可能是保加利亞乳桿菌所不能供給的，從而暗示了在混合培養(yǎng)時，菌株的氮類物質(zhì)（特別是含硫氨基酸）代謝很可能存在更為復(fù)雜的相互作用機制[8]。近幾年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)當(dāng)保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌LMG18311混合發(fā)酵時，后者的氨基酸代謝發(fā)生明顯變化[14]。首先體現(xiàn)在纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸這三種支鏈氨基酸（BCAA）的合成中。支鏈氨基酸不僅對促進嗜熱鏈球菌的生長具有重要作用，而且還是乳酸菌蛋白質(zhì)組成的重要物質(zhì)，約占總蛋白質(zhì)氨基酸含量的20%[9]。更為重要的是支鏈氨基酸的合成途徑廣泛存在于嗜熱鏈球菌中，而在保加利亞乳桿菌中卻不存在[7]。纈氨酸和異亮氨酸需要以丙酮酸鹽為前體，在lvBN，IlvC，IlvD1和AT四種酶的催化作用下生成，而亮氨酸的形成還需要LeuA，LeuD和LeuB這三種酶的參與。在保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌的生長高峰期，ilvC和ilvD1基因的轉(zhuǎn)錄以及IlvC、IlvB、LeuB的含量均有所提高。與此同時，異亮氨酸和纈氨酸的tRNA合成酶IleS和ValS的含量也增加。這說明保加利亞乳桿菌促進了嗜熱鏈球菌中支鏈氨基酸的合成，從而滿足彼此對氨基酸的需求并促進各菌株的生長繁殖，從而實現(xiàn)兩種菌的互惠共生[14]。其次，嗜熱鏈球菌中精氨酸的合成量增加。精氨酸的合成需要以谷氨酸鹽作為底物經(jīng)過ArgJ，ArgB，ArgC和ArgD四種酶的作用生成鳥氨酸，鳥氨酸在經(jīng)過ArgF，ArgG和ArgH三種酶的作用后形成。值得注意的是，ArgH在分解精氨酸琥珀酸酯的同時產(chǎn)生延胡索酸和精氨酸。在共生條件下，嗜熱鏈球菌的argCJBD和argH基因的轉(zhuǎn)錄增加。RTqPCR結(jié)果顯示，argH基因過表達了約57倍。同時，延胡索酸的含量也不斷增加，從最初的45μmol/L可以達到最后的131μmol/L[10]。除此之外，研究還發(fā)現(xiàn)在共生條件下，嗜熱鏈球菌中與蘇氨酸的生物合成途徑相關(guān)的thrB基因也產(chǎn)生超表達現(xiàn)象，說明很可能改變了參與酸乳中重要風(fēng)味物質(zhì)乙醛生成的蘇氨酸的合成。實際上，許多氨基酸和短肽都是酸乳中的風(fēng)味物質(zhì)或是風(fēng)味物質(zhì)的前體?；旌习l(fā)酵提高了氨基酸以及短肽的產(chǎn)量，使更多的風(fēng)味物質(zhì)得以生成，改善了酸奶的產(chǎn)品風(fēng)味。我們在實驗中就曾發(fā)現(xiàn)，一些單菌發(fā)酵會產(chǎn)生苦味物質(zhì)的菌株與某些菌株混合發(fā)酵后可以減弱甚至消除這種苦味。所以，保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌的共生不僅促進了菌株的生長繁殖，還改善了酸乳的品質(zhì)。2.2 核苷酸堿基代謝對于所有的生物而言，核苷酸類物質(zhì)是極為必要的。它們不僅是RNA和DNA生物合成的底物，而且還是細(xì)胞代謝的能量載體[9]。在乳中，嘌呤核苷酸類物質(zhì)是限制嗜熱鏈球菌生長的主要因素。嗜熱鏈球菌中嘌呤核苷酸類物質(zhì)的合成從PRPP在乳中，嘌呤核苷酸類物質(zhì)是限制嗜熱鏈球菌生長的主要因素。嗜熱鏈球菌中嘌呤核苷酸類物質(zhì)的合成從PRPP(5-phosphoribosyl-α-1-pyrophosphate）到IMP要利用9種酶，然后分別通過兩組不同的酶purA，purB和guaB，guaA形成AMP和GMP。嗜熱鏈球菌的基因組中包含了與嘌呤生物合成相關(guān)的所有酶的基因[11]。有研究表明，在乳中加入嘌呤類物質(zhì)后將更有利于嗜熱鏈球菌的生長。但是將嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌進行混合培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，盡管嗜熱鏈球菌的生長得到了促進，但是嗜熱鏈球菌中嘌呤的生物合成卻出現(xiàn)了減弱現(xiàn)象[12]。這表明在混合培養(yǎng)過程中，保加利亞乳桿菌可能給嗜熱鏈球菌提供了嘌呤類物質(zhì)或者嘌呤類物質(zhì)前體。以下幾點可以支持這一理論：第一，保加利亞乳桿菌擁有完整的嘌呤合成途徑，且培養(yǎng)基中含有豐富的嘌呤類物質(zhì)。第二，嗜熱鏈球菌中編碼嘌呤和嘌呤底物轉(zhuǎn)運蛋白的基因出現(xiàn)超表達的現(xiàn)象，如編碼黃嘌呤/尿嘧啶通透酶的基因（stu0336）。此外，編碼磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶的四個基因Hpt，Apt，Xpt和HprT也出現(xiàn)超表達現(xiàn)象，同時它們還參與核苷酸堿基的磷酸化。第三，在嗜熱鏈球菌的培養(yǎng)基中添加嘌呤類物質(zhì)，可以導(dǎo)致與其嘌呤核苷酸類物質(zhì)合成相關(guān)的PurM，PurH，F(xiàn)hs等酶類的表達出現(xiàn)下調(diào)現(xiàn)象，說明外源嘌呤類物質(zhì)可以抑制嗜熱鏈球菌本身擁有的與嘌呤類物質(zhì)相關(guān)的生物合成途徑[13]。第四，與嗜熱鏈球菌嘌呤核苷酸合成相關(guān)的PurR基因出現(xiàn)超表達現(xiàn)象。此外，控制PRPP合酶生成的prsA1基因出現(xiàn)下調(diào)現(xiàn)象。嗜熱鏈球菌中的PurR是一種并發(fā)性的阻抑蛋白，其阻抑機制與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae）[14]類似。當(dāng)向媒介中添加嘌呤類物質(zhì)時，PrsA1（PRPP合酶）的活性受到抑制，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的PRPP的濃度降低，此時，PurR阻抑蛋白被激活并對嘌呤的合成進行抑制。綜上所述，prsA1基因表達的下降說明嗜熱鏈球菌在嘌呤核苷酸類物質(zhì)合成的中間環(huán)節(jié)受到抑制，而PurR基因的過表達現(xiàn)象可能與保加利亞乳桿菌的嘌呤類物質(zhì)的大量合成有關(guān)，從而更有利于菌株的共同生長。2.3 氧化性應(yīng)激雖然氧氣對大多數(shù)乳酸菌的生長起著非常重要的作用，但在有氧呼吸作用過程中會產(chǎn)生一些活性氧（ROS），如過氧化氫、羥自由基以及超氧自由基等。這些物質(zhì)會觸發(fā)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)以及核酸等大分子物質(zhì)的氧化，從而對乳酸菌產(chǎn)生致命的損害[15]。最近，人們通過實驗發(fā)現(xiàn)某些保加利亞乳桿菌在生長過程中會產(chǎn)生少量的過氧化物。在對S.thermophilus LMG18311和產(chǎn)過氧化物的保加利亞乳桿菌進行共生機制研究時發(fā)現(xiàn)，嗜熱鏈球菌中所有發(fā)生表達變化的基因中與鐵代謝相關(guān)的約20%。這說明在共生過程中嗜熱鏈球菌發(fā)生氧化性應(yīng)激反應(yīng)[10]。此外，過氧化物的存在會破壞Fe-S物質(zhì)的結(jié)構(gòu)[16]。2008年，有人指出混合發(fā)酵與嗜熱鏈球菌單菌發(fā)酵相比較，與嗜熱鏈球菌Fe-S物質(zhì)合成有關(guān)的stu0164和sufD基因發(fā)生高水平表達現(xiàn)象，從而說明在菌株共同生長過程中有過氧化物產(chǎn)生。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在生長高峰期，與保加利亞乳桿菌二價鐵轉(zhuǎn)運蛋白合成相關(guān)的feoA基因的表達水平降低，而一種可以提高嗜熱鏈球菌對過氧化氫耐受性的胞內(nèi)鐵蛋白的dpr基因得到了高度的表達。在共同發(fā)酵的最后階段，伴隨著保加利亞乳桿菌所產(chǎn)生過氧化物濃度的降低，嗜熱鏈球菌通過誘導(dǎo)多種機制降低細(xì)胞內(nèi)的鐵濃度。與此同時，與DNA轉(zhuǎn)葡糖基酶編碼相關(guān)的mutS，mutY和ung基因也發(fā)生高表達，而DNA轉(zhuǎn)葡糖基酶在修復(fù)由于氧化性應(yīng)激對DNA造成的損害方面具有重要作用[17]。這種代謝現(xiàn)象有利于通過芬頓反應(yīng)限制共生環(huán)境中活性氧類物質(zhì)的含量，從而保證了保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的協(xié)調(diào)共生。2.4 糖代謝嗜熱鏈球菌依靠非磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)中的乳糖通透酶（LacS）將乳糖運輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)，乳糖在β-半乳糖苷酶（LacZ）的作用下將乳糖作為碳源并轉(zhuǎn)化為葡萄糖和半乳糖[18]。值得注意的是，多數(shù)的嗜熱鏈球菌只能利用分解后的葡萄糖產(chǎn)生乳酸而只有少數(shù)的Gal+菌株能通過Leloir途徑分解半乳糖。而保加利亞乳桿菌通過磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)進行乳糖的運輸，對于半乳糖幾乎不利用（只有極少數(shù)菌株在乳糖含量有限的環(huán)境中會利用半乳糖）。但我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，某些保加利亞乳桿菌或嗜熱鏈球菌在蔗糖中要明顯好于在葡萄糖中的生長狀況，這說明乳酸菌對雙糖的利用可能存在更復(fù)雜的機制。保加利亞乳桿菌由于缺少丙酮酸甲酸裂解酶從而缺少生長需要的嘌呤和甲酸[19]。早在20世紀(jì)60年代末，Galesloot等人就發(fā)現(xiàn)經(jīng)過熱處理的乳中含有甲酸鈉，在促進保加利亞乳桿菌的生長方面具有重要作用[20]。但是在實際生產(chǎn)中多采用較溫和的處理方法，所以甲酸鈉形成不多，促進效果并不明顯。而嗜熱鏈球菌可在無氧或低氧條件下利用糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸生成甲酸，同時利用尿酶的催化作用將尿素降解生成二氧化物促進保加利亞乳桿菌的生長，從而實現(xiàn)兩種菌株的互惠共生。最近，人們在對S.thermophilus LMG18311與保加利亞乳桿菌的共生機制研究時，發(fā)現(xiàn)在混合培養(yǎng)過程中嗜熱鏈球菌中與Leloir途徑相關(guān)的兩種蛋白GalE1，GalK，以及GlmS 和戊糖磷酸途徑相關(guān)的rpe基因均出現(xiàn)過表達現(xiàn)象，這些變化影響乳酸菌的生長速度[8]。GlmS可以利用6-磷酸果糖參與核苷酸糖以及核苷酸氨基糖的合成。GalE1、GalK通過Leloir途徑生成葡萄糖-1-磷酸，這種物質(zhì)既是Leloir途徑與葡萄糖代謝途徑相連接的重要物質(zhì)，也是胞外多糖和鼠李糖等多糖類物質(zhì)合成所需的核苷酸糖的前體。這兩種物質(zhì)的高表達有利于提高乳酸菌對半乳糖的利用，從而可以緩解菌株對乳中有限碳源的競爭。目前，人們對于胞外多糖類物質(zhì)的研究還主要集中在如何提高胞外多糖的產(chǎn)量等實用性方面。盡管有人指出胞外多糖不僅在避免細(xì)胞受到機械損傷以及提高抗菌性方面具有重要作用，同時還可以將胞外多糖作為碳源利用。但對胞外多糖以及鼠李糖等多糖的功能仍然缺乏全面的了解。可以確定的是，在保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌的共生過程中多糖類物質(zhì)確實發(fā)生了變化，如胞外多糖產(chǎn)量的增加。我們在實驗中也發(fā)現(xiàn)混合發(fā)酵后酸乳的粘度明顯提高。但更為奇妙的是，Bouzar還發(fā)現(xiàn)保加利亞乳桿菌單獨發(fā)酵的發(fā)酵乳中的胞外多糖和保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌共同發(fā)酵的發(fā)酵乳中的胞外多糖的組成成分不同[21]，這其中的機制需要進一步的研究。3 結(jié)束語自1980年以來，雖然科研者們對保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌的共生機制的研究取得了一定的成果，但由于乳酸菌個體差異性比較大，所以共生機制的研究一直比較緩慢，對某些在共生過程中發(fā)生變化的機理仍然沒有得到全面的了解。但是，我們深信伴隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，人們可以運用更為先進的手段對乳酸菌的共生機制進行大量而全面的研究，從而為乳酸菌的選育與應(yīng)用提供更為廣闊的空間。
《中國乳品工業(yè)》 2011年12期
包維臣 陳霞 邵玉宇 烏蘭 張興昌 劉娜 曾鳳澤 伊利那·塞日波納·哈瑪耶娃 齊齊格瑪·達西耶那·扎木斯日諾娃 孫天松【摘要】：乳酸菌在乳中的共生機制是非常復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)體系。通過對蛋白質(zhì)代謝、核苷酸堿基代謝、氧化性應(yīng)激以及碳源物質(zhì)代謝等方面的研究,對保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌共生機理的研究進展進行詳細(xì)的闡述。旨在為發(fā)酵劑菌體的篩選及應(yīng)用提供參考。【作者單位】： 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室;俄羅斯東西伯利亞州立技術(shù)大學(xué);【關(guān)鍵詞】： 保加利亞乳桿菌嗜熱鏈球菌共生機理
