Ti質粒的來源
大多數以植物作為宿主有機體的克隆載體都以Ti質粒為基礎，Ti產生于一種稱為根癌農桿菌的土壤細菌。

Ti質粒的特點
根癌農桿菌侵入植物組織后，可導致冠癭的癌性生長。在根癌農桿菌的感染過程中，Ti內稱為T-DNA的部分整合到植物染色體DNA中。
Ti質粒的應用
以Ti質粒為基礎的克隆載體，利用T-DNA的整合能力，攜帶有用基因進入植物基因組中，這些基因可使植物具有抗病等有利特征。
（1）Ti 質粒的結構與功能
Ti 質粒是根癌農桿菌染色體外的遺傳物質，為雙鏈共價閉合的環(huán)狀DNA分子。Ti 質粒大約在160～240kB之間。其中T-DNA大約在15kb-30kb。根據其誘導的植物冠癭瘤中所合成的冠癭堿種類，Ti 質粒可分為4 類：章魚堿型(octopine)、胭脂堿型(nopaline)、農桿堿型(agropine)和農桿菌素堿型(agrocinopine)。
Ti 質粒可分為4 個功能區(qū)域：①T-DNA區(qū)(transferred-DNAregion)：T-DNA是根癌農桿菌侵染植物細胞時從Ti 質粒上切割下來轉移到植物細胞的一段DNA；②Vir 區(qū)(virulence region)：Vir 區(qū)上的基因能激活T-DNA 轉移，使根癌農桿菌表現出毒性；③Con 區(qū)(regions encodingconjugations，接合轉移編碼區(qū))：該區(qū)段上存在與細菌間接合轉移的有關基因，調控Ti 質粒在農桿菌之間的轉移；④Ori區(qū)(origin ofreplication，復制起始區(qū))：Ori區(qū)上的基因調控Ti 質粒的自我復制。
T-DNA上共含有tms、tmr和tmt 3 套基因。其中tms和tmr 2 套基因分別控制合成植物生長素與分裂素，促使植物創(chuàng)傷組織無限制地生長與分裂，形成冠癭瘤。tms基因組由iaaH和iaaM 2 個基因組成，控制由色氨酸產生生長素吲哚乙酸的生物合成途徑；tmr 基因組中的iptZ 負責由異戊烯焦磷酸和AMP 合成分裂素的反應；tmt 基因組的編碼產物可催化合成冠癭堿(Opines)。冠癭堿的代謝產物為氨基酸和糖類，是根癌農桿菌生長必需的物質，供根癌農桿菌作為營養(yǎng)使用。
此外，在T-DNA 的兩端還含有左右2 個邊界，左邊界(left border, LB)和左邊界(right border, RB)是長為25bp的末端重復順序，在切除及整合過程具有重要意義。
（2）Ti 質粒的轉化機理
根癌農桿根瘤菌之所以會感染植物根部是因為植物根部損傷部位會分泌出酚類物質乙酰丁香酮和羥基乙酰丁香酮，這些酚類物質能誘導Ti 質粒上的vir基因以及根癌農桿菌染色體上的一個操縱子表達。vir 基因產物將Ti 質粒上的T-DNA 單鏈切下，而根癌農桿菌染色體上的操縱子表達產物則與單鏈T-DNA 結合形成復合物，轉化植物根部細胞。整個過程大致可分為以下幾個步驟：①根癌農桿菌對植物細胞的識別和附著；②根癌農桿菌對植物信號物質的感受；③根癌農桿菌Ti 質粒上的vir 基因以及染色體上操縱子的活化；④T-DNA 復合體的產生；⑤T-DNA復合體的轉運；⑥T-DNA整合到植物基因組中。
（3）野生型Ti 質粒的改造和中間載體的構建
Ti 質粒是植物基因工程的一種天然載體。但野生型Ti 質粒不能直接用作克隆外源基因的載體。這主要表現在：①野生型Ti 質粒分子過大，因而在基因工程中操作起來十分麻煩；②野生型Ti 質粒上分布著各種限制型核酸內切酶的多個酶切位點，不論用何種限制型核酸內切酶切割，都會切成很大片段。而且即使在T-DNA 上也很難找到可利用的單一的酶切位點；③T-DNA上的tms和tmr 基因產物將干擾受體植物內源激素的平衡，導致冠癭瘤的產生，阻礙轉基因植物細胞的分化和植株的再生；④冠癭堿的合成過程消耗大量的精氨酸和谷氨
酸，直接影響轉基因植物細胞的生長代謝；⑤野生型Ti 質粒沒有大腸桿菌(Escherichia coli)的復制起點和作為轉化載體的選擇標記基因。因此，必須對野生型的Ti 質粒進行改造后才能作為轉基因植物的載體。
對野生型Ti 質粒的改造，主要包括以下幾個方面：①刪除T-DNA上的tms、tmr和tmt
基因；②加入大腸桿菌復制起點和選擇標記基因，構建根癌農桿根瘤菌-大腸桿菌穿梭質粒，便于重組分子的克隆與擴增；③引入植物細胞的篩選標記基因，如細菌來源的新霉素磷酸轉移酶II基因(neomycin phosphotransferase II, NPTII)等，便于轉基因植物細胞的篩選；④引入植物基因的啟動子和polyA化信號序列；⑤插入人工多克隆位點，以利于外源基因的克隆。⑥除去Ti 質粒上的其它非必需序列，最大限度地縮短載體的長度。由于大腸桿菌具有能與根癌農桿菌高效接合轉移的特征。因此，為了使Ti 質粒成為有效的外源基因導入載體，科學家們將T-DNA片段克隆進大腸桿菌的質粒，并插入目的基因，而后通過接合轉移將目的基因引入到根癌農桿菌的Ti 質粒。帶有重組T-DNA的大腸桿菌衍生載體稱為中間載體(intermediatevector)，而接受中間載體的Ti 質粒則稱為受體Ti 質粒(acceptor Ti plasmid)。構建中間載體是解決Ti 質粒不能直接導入目的基因的有效方法之一。
中間載體是一種在一個普通大腸桿菌的克隆載體(如pBR322 質粒)中插入了一段合適的T-DNA片段而構成的小型質粒。
（4）中間載體的表達構建
在中間載體中加上能在植物細胞中表達的各種啟動子，可使外源基因在植物細胞中表達；當啟動子與顯性選擇標記基因及報告基因連接，構成嵌合基因(chimeric gene)時，這些標記基因同樣能表達，從而可提供用于篩選和鑒定的表型。這類含植物啟動子的中間載體稱為中間表達載體(intermediate expressionvector)。
目前已從動物、植物、病毒及微生物中分離到許多適用于植物的啟動子。根據作用方式及功能可將啟動子分為3 類：組成型啟動子、誘導型啟動子和組織特異型啟動子。
①組成型啟動子(constitutivepromoter)是指在該類啟動子控制下，結構基因的表達大體恒定在一定水平上，在不同組織、部位表達水平沒有明顯差異。目前使用最廣泛的組成型啟動子是花椰菜花葉病毒(CaMV)35S 啟動子、來自根癌農桿菌Ti 質粒T-DNA 區(qū)域的胭脂堿合成酶基因Ocs 啟動子，后者雖來自細菌，但具有植物啟動子的特性。
②組織特異啟動子(tissue-specificpromoter)又稱器官特異性啟動子。在這類啟動子調控下，基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達，并表現出發(fā)育調節(jié)的特性。例如煙草的花粉絨氈層細胞中特異表達基因啟動子TA29，豌豆的豆清蛋白(leguimin)基因啟動子可在轉化植物種子中特異性表達，馬鈴薯塊莖儲藏蛋白(patatin)基因啟動子在塊莖中優(yōu)勢表達。
③誘導型啟動子(induciblepromoter)是指在某些特定的物理或化學信號的刺激下，該種類型的啟動子可以大幅度地提高基因的轉錄水平。目前已經分離了光誘導表達基因啟動子、熱誘導表達基因啟動子、創(chuàng)傷誘導表達基因啟動子、真菌誘導表達基因啟動子和共生細菌誘導表達基因啟動子等。
目前植物基因工程中常采用的終止子是胭脂堿合成酶的nos終止子和Rubisco小亞基基因的3′端區(qū)域。
（5）植物表達載體的構建
中間表達載體是不能將外源基因轉化進植物細胞。因此，必須將中間表達載體引入到上述已改造的受體Ti 質粒中，并構建成能侵染植物細胞的基因轉化載體(它是由兩種以上質粒構成的復合型載體，故稱之為載體系統(tǒng))，才能在植物基因轉化中應用。為利用根癌農桿菌的Ti 質粒，發(fā)展了一元載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)。一元載體系統(tǒng)是指首先將目的基因插入到中間表達載體上，篩選出含有目的基因的重組分子，然后將重組質粒轉化到根癌農桿菌中，重組質粒與Ti 質粒上的同源序列發(fā)生同源重組，將外源基因整合到Ti 質粒上，用于侵染植物細胞。T-DNA 重組分子就可整合到植物細胞染色體DNA 上。
最后利用植物選擇標記基因篩選轉化細胞。簡單而言，一元載體系統(tǒng)就是指含有目的基因的中間表達載體與改造后的受體Ti 質粒通過同源重組所產生的一種復合型載體，通常又稱為共整合載體(co-integrated vector)；由于該載體的T-DNA區(qū)與Ti 質粒Vir 區(qū)連鎖，因而又稱為順式載體(cis-vector)。
雙元載體(binary vector)系統(tǒng)是指由兩個分別含T-DNA和Vir區(qū)的相容性突變Ti質粒構成的系統(tǒng)。其中之一是含有T-DNA轉移所必需的Vir 區(qū)段質粒，它缺失或部分缺失T-DNA序列。它的主要作用是表達毒蛋白，激活T-DNA 的轉移，故稱為輔助Ti 質粒(helper Ti plasmid)；另一個則是含有T-DNA的質粒。一般作為目的基因的載體，由于其分子量較小，故稱為微型質粒(mini-Ti plasmid)。它是一種寄主范圍廣泛的DNA轉移載體質粒。它既含有大腸桿菌復制起始位點，又含有根癌農桿菌復制起始位點，實際上是一種大腸桿菌-農桿菌穿梭質粒。這兩種質粒在單獨存在的情況下，均不能誘導植物產生冠癭瘤。若根癌農桿菌細胞內同時存在這兩種質粒時，便可獲得正常誘導腫瘤的能力。因此，含有雙元載體的根癌農桿菌細胞浸染植物時，就可以將含有目的基因的T-DNA整合進植物基因組中。
目前以T-DNA轉化植物細胞的標準方法大多采用Ti 質粒介導的雙元載體系統(tǒng)。首先將目的基因插入到微型質粒，含有目的基因的重組微型質粒轉化大腸桿菌后，再導入攜帶輔助Ti 質粒的根癌農桿菌中，經篩選后直接感染植物細胞。根癌農桿菌侵染植物細胞后，植物的創(chuàng)傷信號啟動Ti 質粒上的vir基因，隨后將微型質粒上的T-DNA切割下來，轉移到植物細胞中。由于雙元載體系統(tǒng)的T-DNA和Vir 區(qū)在兩個獨立的質粒上，通過反式激活T-DNA轉移，故又稱為反式載體(trans-vector)。
（6）Ti 質粒介導的轉移轉化方法
目前已建立了多種根癌農桿菌Ti 質粒介導的植物基因轉化方法，其基本程序包括：含重組Ti 質粒的根癌農桿菌的培養(yǎng)，選擇合適的外植體，根癌農桿菌與外植體共培養(yǎng)，外植體脫毒及篩選培養(yǎng)，轉化植株再生等步驟。
葉盤轉化法：
葉盤轉化法(leaf dishtransformation)是Monsanto公司Morsch等人(1985)建立起來的一種轉化方法。其操作步驟為：首先用打孔器從消毒葉片上取下直徑為2～5mm 圓形葉片，即葉盤。再將葉盤放入培養(yǎng)至對數生長期的根癌農桿菌液浸泡幾秒鐘，使根癌農桿菌浸染葉盤。
然后用濾紙吸干葉盤上多余的菌液，將這種經浸染處理過的葉盤置于培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2～3d，再轉移到含有頭孢霉素或羧芐青霉素抑菌劑的培養(yǎng)基中，除去根癌農桿菌。與此同時在該培養(yǎng)基中加入抗生素進行轉化體的篩選，使轉化細胞再生為植株。對這些再生植物進行分子檢測就可確定它們是否整合有目的基因及其表達情況。
葉盤轉化法已在多種雙子葉植物上得到成功的應用。實際上，其他的多種外植體，例如莖段、葉柄、胚軸、子葉愈傷組織、萌發(fā)的種子均可采用類似的方法進行轉化。該方法的優(yōu)點是適用性廣且操作簡單，是目前應用最多的方法之一。
原生質體共培養(yǎng)轉化法：
原生質體共培養(yǎng)轉化法是以原生質體作為受體細胞，通過將根癌農桿菌與原生質體作短暫的共培養(yǎng)，然后洗滌除去殘留的根癌農桿菌后，置于含抗生素的選擇培養(yǎng)基上篩選出轉化細胞，進而再生成植株。與葉盤轉化法相比，此法得到的轉化體不含嵌合體，一次可以處理多個細胞，得到相對較多的轉化體。應用此法進行基因轉化時，其先決條件就是要建立起良好的原生質培養(yǎng)和再生植物技術體系。
整株感染法：
此法是模仿根癌農桿菌天然的感染過程，用根癌農桿菌直接感染植物而進行遺傳轉化的一種簡單易行的方法。其做法是：人為地在植株上造成創(chuàng)傷，然后把含有重組質粒的根癌農桿菌接種在創(chuàng)傷面上，或把含有重組質粒的根癌農桿菌注射到植物體內。使根癌農桿菌在植物體內進行浸染實現轉化。為了獲得較高的轉化頻率，一般多采用無菌種子的實生苗或試管苗。用去除了致瘤基因的根癌農桿菌進行整株感染后，受傷部位一般不會出現腫瘤。在篩選轉化體時，可將感染部位的薄壁組織切下放入選擇培養(yǎng)基上及誘發(fā)愈傷組織的培養(yǎng)基上進行篩選和愈傷組織誘導。最后將轉化的愈傷組織轉移至含合適植物激素的培養(yǎng)基上誘導再生植株。
在擬南芥(Arabidopsisthaliana)上，將根癌農桿菌涂于植株腋芽處或頂牙，可長出轉化的新枝條，新的轉化枝條開花結實后，也可以獲得轉基因種子；或者通過真空滲透或農桿菌浸泡擬南芥開花植株，等結實之后，利用篩選萌芽種子的方法，也可以得到轉基因植株及種子。
2 發(fā)根農桿菌介導轉化法
發(fā)根農桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)是與根癌農桿菌同屬的一種病原土壤桿菌。但與根癌農桿菌不同的是，發(fā)根農桿菌從植物傷口入侵后，不能誘發(fā)植物產生冠癭瘤，而是誘發(fā)植物產生許多不定根。這些不定根生長迅速，不斷分枝成毛狀，故稱之為毛狀根或發(fā)狀根(hairy root)。發(fā)狀根的形成是由存在于發(fā)根農桿菌中的Ri質粒(root inducingplasmid,根誘導質粒)所決定的。
Ri 質粒是發(fā)根農桿菌染色體外的遺傳物質。屬于巨大質粒，其大小為200～800kb。Ri質粒和Ti 質粒不僅結構、特點相似，而且具有相同的寄主范圍和相似的轉化機理。與Ri質粒轉化相關的也主要為Vir區(qū)和T-DNA區(qū)2部分。Ri質粒的T-DNA也存在冠癭堿合成基因，且這些合成基因只能在被侵染的真核細胞中表達。根據其誘導的冠癭堿的不同，Ri 質?？煞譃? 種類型：農桿堿型(agropine)、甘露堿型(mannopine)和黃瓜堿型(cucumopine)。與Ti質粒的T-DNA不同的是，Ri質粒的T-DNA上的基因不影響植株再生。因此，野生型Ri質
粒可以直接作轉化載體。
與Ti 質粒相同，Ri質?；蜣D化載體的構建也主要采用有共整合載體和雙元載體系統(tǒng)。由Ri 質粒誘發(fā)產生的不定根組織，經離體培養(yǎng)后，一般都可再生完整的植株。因此，利用Ri質粒作為轉基因植物的載體，同樣具有誘人的前景。

Ti質?？赡芷鹪从诰哂凶灾鲝椭乒δ艿脑即蠓肿?，即Ti質粒起源于自主復制的RNA分子。核糖核酸多聚體具有自主復制的信息和能力。由于發(fā)現RNA分子具有催化化學反應的能力使得RNA為Ti質粒起源的學說變得更具有吸引力。

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