愛華網(wǎng)一、酶免疫組化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)
1、標(biāo)本固定：固定的目的是①防止標(biāo)本從玻片上脫落；②除去防礙抗原-抗體結(jié)合的類脂，使抗原抗體結(jié)合物易于獲得良好的染色結(jié)果；③固定的標(biāo)本易于保存。
2、脫水、石蠟包埋和制片：脫水用梯度乙醇（由低到高）充分脫水、對組織要完全浸蠟、切片時(shí)刀片要干凈和鋒利。否則，容易裂片和脫片等。
3、脫蠟和水化：這是為了后面的抗體等試劑能夠充分與組織中抗原等結(jié)合反應(yīng)。脫蠟可以先60度20min，然后立即二甲苯1-3分別10min，但當(dāng)天制好的切片可以60度3-4h。水化用梯度乙醇（由高到低）。若脫蠟和水化不全易出現(xiàn)局灶性反應(yīng)和浸洗不全，而產(chǎn)生非特異性背景著色。
4、抗原修復(fù)：由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性；通過抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測率。常用的修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。修復(fù)液也分為若干種（具體的可以查閱相關(guān)資料，大量的：中性的、高pH的等）。我們實(shí)驗(yàn)室一般用微波修復(fù)中火6min*4次，效果不錯(cuò)。注意微波修復(fù)后自然冷卻30min左右（只要你覺得修復(fù)液的溫度達(dá)室溫即可）。
5、細(xì)胞通透：目的是使抗體能夠充分地進(jìn)入胞內(nèi)進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。一般用Triton X-100、蛋白酶k等通透液。如TritonX-100可以溶解細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜、細(xì)胞器膜上的脂質(zhì)而使抗體及大分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進(jìn)入胞漿和胞核內(nèi)，故在細(xì)胞免疫組化時(shí)尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進(jìn)入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。在免疫組織化學(xué)（>10um厚切片）和免疫細(xì)胞化學(xué)中一般用TritonX-100 作為細(xì)胞通透劑，在膜上打孔。
6、滅活內(nèi)源性過氧化物酶和生物素：在傳統(tǒng)的ABC法和SP法中，免疫組化反應(yīng)結(jié)果容易收到內(nèi)源性過氧化物酶和生物素的干擾，必須用過氧化氫和卵白素等進(jìn)行滅活。滅活內(nèi)源性POD一般3%過氧化氫滅活時(shí)間短點(diǎn)，可以10min左右，而0。3%過氧化氫則可以適當(dāng)延長封閉時(shí)間，一般10~30min；用甲醇配置過氧化氫比雙蒸水或PBS可能好在保護(hù)抗原和固定組織作用，過氧化氫孵育時(shí)間過長易引起脫片；現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后4度避光保存。不過，現(xiàn)在已有“第二代即用型免疫組化試劑盒”避免內(nèi)源性生物素的干擾，推薦使用。
7、血清封閉：組織切片上有剩余的位點(diǎn)可以與一抗非特異性結(jié)合，造成后續(xù)結(jié)果的假陽性；封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動(dòng)物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合；也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來源一致。一般室溫或37度10-30min。
8、一抗和二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間：一抗孵育條件在免疫組化反應(yīng)中最重要，包括孵育時(shí)間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最佳；孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37度1-2h，而4度過夜和從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min。具體條件還要摸索。二抗孵育條件：二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時(shí)間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度。但在免疫組化中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間。
9、抗體稀釋液：其實(shí)許多實(shí)驗(yàn)室抗體稀釋液就用一般PBS即可，但專用的抗體稀釋液中除PBS成份外，還加了疊氮化鈉防腐劑、BSA穩(wěn)定劑等組份，對抗體的多次回收利用較好。正因?yàn)檫@種原因，我一直用國產(chǎn)的專用抗體稀釋液，一段時(shí)間在更換新抗體稀釋液時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)了陰性結(jié)果（提示可能一抗沒有結(jié)合），最后從抗體濃度和孵育時(shí)間、封閉時(shí)間等原因排除后，發(fā)現(xiàn)是新抗體稀釋液的PH值偏酸，而使抗原抗體反應(yīng)不佳，終而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
10、切片清洗（浸洗、沖洗和漂洗）：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗（延長時(shí)間和增多次數(shù)）尤為重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。
注意：（1）單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。（2）溫柔沖洗，防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式；（3）沖洗的時(shí)間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。（4）PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓(xùn)，當(dāng)時(shí)我買的抗體稀釋液偏酸，結(jié)果背景一片黃（未見特異性染色），建議PH在7.4-7.6濃度是0.01M。（中性及弱鹼性條件（PH7-8）有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解）
11、DAB顯色：背景的深淺和特異性染色的深淺均可以由DAB孵育條件決定。DAB顯色時(shí)間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)間，到出現(xiàn)特異性染色較強(qiáng)而本底著色較淺時(shí)即可沖洗；DAB顯色時(shí)間很短（如幾秒或幾十秒）就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時(shí)間過長，需要下調(diào)抗體濃度或縮短你的抗體孵育時(shí)間；此外，若很短時(shí)間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長封閉時(shí)間；DAB顯色時(shí)間很長（如超過十幾分鐘）才出現(xiàn)陽性染色，一方面可能說明你的抗體濃度過低或孵育時(shí)間過短（最好一抗4度過夜）；另一方面就是封閉時(shí)間過長。
12、復(fù)染：目的是形成細(xì)胞輪廓，從而更好地對目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位，經(jīng)常用蘇木素復(fù)染（胞核染料）。注意蘇木素復(fù)染時(shí)間要看當(dāng)時(shí)的室溫、溶液的新舊、目標(biāo)抗原的定位等情況，一般數(shù)秒-數(shù)分鐘，胞漿蛋白可以適當(dāng)時(shí)間長一點(diǎn)，而胞核蛋白則要短。不過這個(gè)如果染色不理想可以補(bǔ)救的。即：染色深則分化時(shí)間稍長些即可；染色淺則再置于蘇木素中染色即可。
鹽酸酒精是分化，氨水是返蘭。作用不同。片子復(fù)染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中數(shù)秒（一定動(dòng)作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蘭即可。
13、封片：為了長期保存，我們一般用中性樹膠等封片，避免產(chǎn)生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個(gè)拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時(shí)為止；當(dāng)發(fā)現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時(shí)，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會(huì)產(chǎn)生氣泡。
二、免疫熒光方法中的重要環(huán)節(jié)
1、冰凍切片制備：建議用新鮮組織，否則組織細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)破壞，易使抗原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等，防止裂片和脫片嚴(yán)重。
2、組織切片固定：切好片風(fēng)干后立即用冰丙酮等固定液進(jìn)行固定5-10min，尤其要較長時(shí)間保存的白片，一定要及時(shí)固定和適當(dāng)保存。
3、血清封閉：為防止內(nèi)源性非特異性蛋白抗原的結(jié)合，需要在一抗孵育前先用血清（與二抗來源一致）封閉，減弱背景著色。血清封閉的時(shí)間是可以調(diào)整的，一般10-30min。
4、一抗孵育條件：在免疫組化反應(yīng)中最重要，包括孵育時(shí)間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最佳；孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37度1-2h，而4度過夜和從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min。具體條件還要摸索。
5、二抗孵育條件：二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時(shí)間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度，切記要避光反應(yīng)。但在免疫熒光中我們一般先把二抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間先定下，然后去摸索一抗?jié)舛群头跤龝r(shí)間。最后，熒光素標(biāo)記的二抗隨著保存時(shí)間的延長，可能后有大量的游離熒光素殘留，需要注意配制時(shí)小包裝和并進(jìn)行適當(dāng)?shù)碾x心。
6、復(fù)染：目的是形成細(xì)胞輪廓，從而更好地對目標(biāo)蛋白進(jìn)行定位。一般常用DAPI復(fù)染。
7、封片：為了長期保存，我們一般用緩沖甘油等封片，此外還有專門的抗熒光萃滅封片液。避免產(chǎn)生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然后一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個(gè)拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時(shí)為止；當(dāng)發(fā)————現(xiàn)液體接觸面在不斷彌散時(shí)，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會(huì)產(chǎn)生氣泡。
8、切片清洗：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)清洗（延長時(shí)間和增多次數(shù)）尤為重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。注意（1）單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。（2）溫柔沖洗，防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式；（3）沖洗的時(shí)間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。（4）PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用和要求。這方面我有慘痛教訓(xùn)，當(dāng)時(shí)我買的抗體稀釋液偏酸，結(jié)果背景一片黃（未見特異性染色），建議PH在7.4-7.6濃度是0.01M。（中性及弱鹼性條件（PH7-8）有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解）
9、拍照：有條件的話最好立即拍照，若不能及時(shí)拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和濕度。使用熒光顯微鏡注意嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進(jìn)行操作，不要隨意改變程序；應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查；防止紫外線對眼睛的損害，在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡；檢查時(shí)間每次以1~2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降，熒光減弱；標(biāo)本受紫外線照射3~5min后，熒光也明顯減弱或褪色；激發(fā)光長時(shí)間的照射，會(huì)發(fā)生熒光的衰減和淬滅現(xiàn)象；所以最多不得超過2~3h；熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié)省時(shí)間，保護(hù)光源。天熱時(shí)，應(yīng)加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時(shí)間。燈熄滅后欲再啟用時(shí)，須待燈光充分冷卻后才能點(diǎn)燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源。關(guān)閉汞燈至少在開啟15-30分鐘后；標(biāo)本染色后立即觀察，因時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時(shí)間，防止封裱劑蒸發(fā)；使用的玻片等載體，都必須厚度均勻，無明顯的自發(fā)熒光，如果使用油鏡，還必須保證鏡油為無熒光鏡油；電源最好裝穩(wěn)壓器，否則電壓不穩(wěn)不僅會(huì)降低汞燈的壽命，也會(huì)影響鏡檢的效果。
免疫組化染色過程中存在的問題、原因分析及其對策良好的免疫組化染色切片是正確判斷染色結(jié)果的基礎(chǔ)和前提。由于免疫組化染色過程中存在很多步驟或環(huán)節(jié)，每一個(gè)步驟或環(huán)節(jié)都可能影響到染色的最終結(jié)果，因此，要做好一張高質(zhì)量的免疫組化切片并不是一件非常容易的事。需要病理技術(shù)員和病理醫(yī)生密切配合、相互協(xié)調(diào)、共同努力才能保證做出合格的免疫組化切片。雖然免疫組化染色可以存在各種各樣的問題，但從染色的結(jié)果看，一般可分為兩類：無色片（即無陽性信號(hào)）和“雜音”染色片（有陽性信號(hào)）。
一、無色片
染色結(jié)束后，切片中見不到任何陽性信號(hào)。這是常規(guī)工作中比較常見的現(xiàn)象，出現(xiàn)這種現(xiàn)象，有兩種可能：1、真陰性結(jié)果：整個(gè)染色過程沒有出現(xiàn)問題，組織或細(xì)胞確實(shí)不表達(dá)與抗體相關(guān)的抗原。2、假陰性結(jié)果：即此陰性結(jié)果不是真實(shí)的反映。假陰性結(jié)果又可分為兩種情況：（1）切片中根本就不包含所預(yù)期檢查的組織或細(xì)胞。出現(xiàn)這種情況，要麼是病理醫(yī)生選擇錯(cuò)了切片或抗體選錯(cuò)了，要麼是技術(shù)員選錯(cuò)了蠟塊。獲得正確的切片進(jìn)行染色是獲得正確結(jié)果的前提。由此表明：制作出合格的免疫組化切片不僅僅是技術(shù)員的事，病理醫(yī)生也起著不可缺少的作用。（2）染色過程中的某一或某些環(huán)節(jié)出了問題。比如，組織未進(jìn)行抗原修復(fù)，有的組織必須經(jīng)過抗原修復(fù)才能檢測抗原表達(dá)；或選用了只能用于冰凍組織而不能用于石蠟包埋組織的抗體；或一抗失效，雖然抗體失效在理論上是一個(gè)逐漸的過，但偶爾也遇到突然失效的情況，抗體長期不用和/或已超過有效期是主要的原因。也可見于染色過程中漏掉了某一環(huán)節(jié)，如忘記加二抗或三抗，或用了兩次二抗而缺少了三抗，或配制DAB時(shí)少了過氧化氫。為了避免這種簡單的錯(cuò)誤，有一種簡單的方法：在三抗孵育結(jié)束時(shí)，將切片上的三抗甩在一張白紙上，在將配制好的DAB滴一滴在白紙的三抗上，觀察是否出現(xiàn)棕色。如果出現(xiàn)了，證明三抗和DAB的配制過程沒有錯(cuò)誤。如果這種DAB再滴到切片上沒有出現(xiàn)任何陽性信號(hào)，問題一定是出在三抗以前。如果紙上不出現(xiàn)棕色反應(yīng)，問題肯定在三抗或DAB的配制過程。這種簡單方法能迅速的幫助我們查找出現(xiàn)問題可能的原因。
解決陰性染色的問題非常簡單，就是設(shè)立“陽性對照”。如果陽性對照有了表達(dá)，說明染色的全過程和所有試劑都沒有問題。如果此時(shí)測試片仍為陰性，便是真實(shí)的陰性，說明組織或細(xì)胞沒有相應(yīng)的抗原表達(dá)。反之，如果陽性對照沒有著色，表明染色過程中某個(gè)或某些步驟出了問題或試劑出了問題。應(yīng)一一尋找原因。陽性對照包括兩種，一種稱為“自身對照”或“內(nèi)部對照”，這是指在測試的切片中本身就存在已知的抗原，如正常淋巴結(jié)中存在T和B細(xì)胞抗原，CD20或CD3都應(yīng)該有表達(dá)。自身對照是一種比較理想的對照，對照和測試組織或細(xì)胞都在同一張切片中，都處于相同的試驗(yàn)條件下，結(jié)果更可靠也更具有可比性。在選擇自身對照片時(shí)最好選擇既有病變組織同時(shí)又有正常組織的部分，這樣有利于對比。另一種稱為“外部對照”，有時(shí)在測試的切片中不存在已知的抗原，如在胃的標(biāo)本中懷疑是惡性黑色素瘤，需要用HMB45或Mart-1來檢測，在正常的胃組織中本身不存在相關(guān)的抗原，如果病變出現(xiàn)陽性反應(yīng)結(jié)果，尚能提示是惡黑，但是如果出現(xiàn)陰性結(jié)果，就無法確定是本身組織中不含黑色素瘤抗原，還是技術(shù)問題。因此，應(yīng)另外設(shè)立一個(gè)已知的陽性對照。這種在測試組織之外的陽性對照稱為“外部對照”。在實(shí)際工作中需要設(shè)立外部對照的情況很多，如果每一種抗體都要選不同的陽性對照，工作量會(huì)很大。為了解決這個(gè)問題，目前國內(nèi)外有單位將多種不同組織集成在一起，制成多組織切片、“臘腸”“春卷”切片、組織芯片等，其連續(xù)切片儲(chǔ)備待用，需要時(shí)取出一張便可作為陽性對照。另外，比較簡單的方法，是采用闌尾作為陽性對照，因?yàn)榕c人體其它組織器官比較闌尾包含的組織種類較多，如有上皮、淋巴組織、平滑肌、間質(zhì)、神經(jīng)、血管、間皮等。一張闌尾切片可以檢測大多數(shù)常用的抗體。
設(shè)立陽性對照是病理醫(yī)生的任務(wù)或責(zé)任，而不是技術(shù)員的責(zé)任。病理醫(yī)生觀察了HE切片，了解切片中是否有自身對照，如果沒有，就應(yīng)告訴技術(shù)員采用陽性對照。因此，病理醫(yī)生在免疫組化中的作用是不可忽視的。抗體未覆蓋上測試組織：當(dāng)多塊散開的小組織染色時(shí)，可能漏掉某塊組織染色。
二、“雜音”染色片
免疫組化除正常的真實(shí)的陽性信號(hào)外常常會(huì)遇到不正常的背景著色，這些非正常的著色稱為“雜音”染色。“雜音”染色種類繁多，產(chǎn)生的原因也多種多樣，為了便于說明，筆者將其歸納為下面幾種。
1、全片著色
全片著色是指整個(gè)切片全都染上了顏色，著色的強(qiáng)度可深可淺，總之，分不清那些組織是陽性那些組織是陰性。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因有：
（1）抗體濃度過高：一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對其工作濃度進(jìn)行測試，使每一抗體個(gè)體化，找到適合自己實(shí)驗(yàn)室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應(yīng)如此，不能只簡單的按說明書進(jìn)行染色。
（2）抗體孵育時(shí)間過長或溫度較高：解決辦法是，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程，最好隨身佩帶報(bào)時(shí)表或報(bào)時(shí)鐘，及時(shí)提醒，避免因遺忘而造成時(shí)間延長?，F(xiàn)在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時(shí)間不是傳統(tǒng)的1小時(shí)，而是30分鐘，因此，要根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。
（3）DAB變質(zhì)和顯色時(shí)間太長：DAB最好現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣應(yīng)進(jìn)行過濾后再用。配制好的DAB不應(yīng)存放時(shí)間太長，因?yàn)樵跊]有酶的情況下，過氧化氫也會(huì)游離出氧原子與DAB產(chǎn)生反應(yīng)而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB的顯色最好在顯微鏡下監(jiān)控，達(dá)到理想的染色程度時(shí)立即終止反應(yīng)。不過當(dāng)染色片太多時(shí)或用染色機(jī)時(shí)，這樣做似乎不現(xiàn)實(shí)，但至少應(yīng)對一些新的或少用的抗體顯色時(shí)進(jìn)行監(jiān)控，避免顯色時(shí)間過長。
（4）組織變干：修復(fù)液溢出后未及時(shí)補(bǔ)充液體、染色切片太多、動(dòng)作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認(rèn)真仔細(xì)，采用DAKO筆或PAPPen在組織周圍畫圈，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。
（5）切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時(shí)間太長（大于24小時(shí)）：原因上不清楚，但現(xiàn)象存在。有的實(shí)驗(yàn)室喜歡前一天將切片脫蠟至修復(fù)，第二天加抗體進(jìn)行免疫組化染色，如果將裝有切片和修復(fù)液的容器放在4度冰箱過夜，對結(jié)果無明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會(huì)出現(xiàn)背景著色，因此，不可存放時(shí)間太長。
（6）一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要麼不顯色要麼背景著色。用新買的抗體時(shí)最好設(shè)立陽性對照和用使用過的抗體作比較。
2、切片邊緣著色
切片邊緣著色也是一種常見的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象稱為邊緣效應(yīng)。產(chǎn)生的原因：（1）組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致。解決辦法：制備優(yōu)質(zhì)的膠片（APES或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚于4微米，組織的前期處理應(yīng)規(guī)范，盡量避免選用壞死較多的組織。（2）切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應(yīng)超出組織邊緣2mm。用DAKO筆畫圈時(shí)，為了避免油劑的影響，畫圈應(yīng)距組織邊緣3-4mm。
3、“陰陽臉”著色
指組織一半著色一半無著色，形成交界清晰或不甚清晰的兩種染色結(jié)果。其成因是試劑僅覆蓋了部分組織而不是全部。如加試劑后未讓試劑流散開而集中在部分組織上。通常應(yīng)該在加完試劑后，仔細(xì)看一遍，是否有的組織未被試劑完全覆蓋，如有這種情況，建議用牙簽而不是用吸頭或試劑瓶口將試劑引流開使之將組織全部覆蓋。另外，染片盒不平，切片傾斜，雖然開始試劑已全部覆蓋了組織，但后來試劑流向一邊，部分組織未被試劑覆蓋。對于這種問題，只要留心或想到了很容易發(fā)現(xiàn)，也很容易解決。有時(shí)，用DAKO（或PAP）筆在組織周圍畫圈時(shí)，劃線太靠近或畫到了組織上，由于筆油的力學(xué)原理，試劑不能達(dá)到靠近劃線附近的組織。還有氣泡也可引起陰陽分明的著色，只是不著色區(qū)域是圓形，由于氣泡中含氣，試劑被推到周圍，因此，氣泡中心的組織不著色。解決辦法是滴加試劑時(shí)手法要輕，有氣泡時(shí)用牙簽捅破。
4、灶片狀著色
切片中著色區(qū)東一塊西一塊，呈灶片狀分布，出現(xiàn)這種問題的原因有：（1）裱片時(shí)水未排盡，在局部形成氣泡使組織突起，染色時(shí)試劑滲入后不易洗盡，顯色過深所致。解決辦法是，漂片盒里的氣泡應(yīng)去盡，晾片熱臺(tái)不能平放，應(yīng)有45度左右的斜度，利于水流走和蒸發(fā)。（2）壞死組織灶，組織壞死后細(xì)胞破壞、酶的釋放、蛋白游離、分解，復(fù)雜的肽鏈殘段（如Fc段）可能與一抗或/和二抗結(jié)合導(dǎo)致最終著色。解決辦法是在選擇染色切片時(shí)應(yīng)避免選擇壞死組織較多的切片。（3）制作APES膠片時(shí)，膠的濃度太高，干燥后在玻片上留下白色小點(diǎn)，顯色時(shí)白色小點(diǎn)著色。解決辦法是按照標(biāo)準(zhǔn)的制備方法進(jìn)行，即5%鹽酸酒精（5ml鹽酸+95%酒精95ml）浸泡玻片4小時(shí)、熱水沖洗玻片1小時(shí)、蒸餾水洗玻片1分鐘、丙酮浸泡玻片5秒鐘后空氣干燥（室溫）、2%APES（2ml APES+98ml丙酮）浸泡玻片5分鐘、玻片過一下丙酮（1-2秒鐘）、玻片過一下蒸餾水（1-2秒鐘）、37度過夜干燥、室溫儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｈ绻破^程中，因丙酮逐漸揮發(fā)而膠變濃時(shí)可適當(dāng)加入一些丙酮。
5、間質(zhì)著色
著色部位主要在間質(zhì)，間質(zhì)著色的原因很多，如抗體與組織中的蛋白質(zhì)因蛋白疏水基團(tuán)相互作用形成非特異性的連接而著色，加一抗前的血清封閉這一步就是為了避免非特異型的結(jié)合。又如血清中的免疫球蛋白常常滲出到組織間質(zhì)，很容易與抗體結(jié)合，造成間質(zhì)著色，特別是lambda和kappa染色時(shí)。當(dāng)甲狀腺膠質(zhì)外溢到組織間質(zhì)時(shí)，做甲狀腺球蛋白染色也會(huì)出現(xiàn)間質(zhì)著色?？贵w不純或抗體被污染也可出現(xiàn)間質(zhì)著色，我們曾遇到CD20抗體不純，除了染上B細(xì)胞外還染上了間質(zhì)。
6、細(xì)胞漿著色
胞漿著色是所有“雜音”染色中最具有欺騙性的著色，著色區(qū)局限在細(xì)胞內(nèi)，間質(zhì)無著色，看上去與真實(shí)的免疫反應(yīng)著色幾乎一樣，很難區(qū)別。胞漿里含有較多的蛋白質(zhì)，因此，很多非特異性的染色除了見于間質(zhì)也可以出現(xiàn)在胞漿中。這種原因造成的著色，可以通過血清封閉解決。還有因內(nèi)源酶造成的著色，如血紅蛋白（紅細(xì)胞）、肌紅蛋白（肌細(xì)胞）、細(xì)胞色素（粒細(xì)胞、單核細(xì)胞）、過氧化氫酶（肝、腎），這些可用過氧化氫進(jìn)行封閉。巨噬細(xì)胞吞噬各種抗原物質(zhì)或Fc片斷而出現(xiàn)胞漿著色，這種著色不易避免，但可以通過形態(tài)學(xué)辨認(rèn)出巨噬細(xì)胞而引起重視。內(nèi)源性生物素的著色最具有欺騙性，因?yàn)樗鼜V泛的存在于組織細(xì)胞中，我們研究結(jié)果顯示：冰凍組織中存在內(nèi)源性生物素，經(jīng)福馬林固定石蠟包埋后生物素被封閉，加熱抗原修復(fù)后造成內(nèi)源性生物素暴露，內(nèi)源性生物素暴露的強(qiáng)度在不同的組織有所不同，從弱陽性（+）到強(qiáng)陽性（+++），內(nèi)源性生物素在組織中的分布形式，既有散在分布也有彌漫分布，主要以顆粒狀形式存在于胞漿中，內(nèi)源性生物素廣泛存在于上皮源性組織，特別是腺上皮組織，亦存在部分非上皮組織，內(nèi)源性生物素不僅存在人體組織也存在大鼠組織，內(nèi)源性生物素暴露的強(qiáng)弱與修復(fù)液有關(guān)，其強(qiáng)度增加依次為：檸檬酸、EDTA、EGTA，熱抗原修復(fù)暴露的內(nèi)源性生物素可被雞蛋清封閉，非生物素檢測系統(tǒng)Polymer兩步法（EliVision、EnVision）可避免生物素干擾。
7、細(xì)胞核著色
不適當(dāng)?shù)慕M織處理可以出現(xiàn)細(xì)胞核著色，如組織在二甲苯里浸泡時(shí)間太長（如從星期五浸泡到下星期一）、緩沖液中浸泡時(shí)間太長、組織變干、微波修復(fù)液的pH值和修復(fù)時(shí)間不當(dāng)或修復(fù)過程中修復(fù)液留下得太少，未沒過組織等。解決辦法是嚴(yán)格按照操作常規(guī)進(jìn)行工作。
免疫組化技術(shù)常見問題及其解答集錦1、石蠟切片和冰凍切片的比較？
（1）要求做冰凍切片的不一定能做石蠟切片，這是今天我向一老師請教得出的結(jié)論。因?yàn)樽魇炃衅瑫r(shí)要高溫烤片，可能會(huì)破壞組織的抗原性，如果組織的抗原性較穩(wěn)定，則可作石蠟切片；但是要求做石蠟切片的，可作冰凍切片。
（2）冰凍切片的優(yōu)點(diǎn)是能夠較好的保存組織的抗原免疫活性，做免疫組化時(shí)不需抗原修復(fù)這一步。缺點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)易形成冰晶而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可能會(huì)使抗原彌散；切片厚度較石蠟的厚，做的片子沒石蠟的漂亮。當(dāng)你買一抗時(shí)，目錄上都寫著做什么樣的切片，如果它寫著只能做冰凍，就不能做石蠟，如寫著兩者都可，那就都能做。
（3）石蠟切片的優(yōu)點(diǎn)可以保持組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，且容易存放在室溫，而冰凍切片比較麻煩，一定要存在-80度的低溫冰箱中，尤其是用來做原位雜交的的切片，為了防止RNA降解，保存一貫很重要。由于石蠟切片可以切到4微米左右，所以原位雜交探針容易滲透到組織中去，容易成功，而且得到的顏色/形態(tài)都較冰凍切片好。
2、一抗的選擇要點(diǎn)和技巧是什么？
（1）單克隆和多克隆抗體的選擇。由一種克隆產(chǎn)生的特異性抗體叫做單克隆抗體。單克隆抗體能目標(biāo)明確地與單一的特異抗原決定簇結(jié)合，就像導(dǎo)彈精確地命中目標(biāo)一樣。另一方面，即使是同一個(gè)抗原決定簇，在機(jī)體內(nèi)也可以由好幾種克隆來產(chǎn)生抗體，形成好幾種單克隆抗體混雜物，稱為多克隆抗體。在抗原抗體反應(yīng)中，一般單克隆抗體特異性強(qiáng)，但親和力相對小，檢測抗原靈敏度相對就低；而多克隆抗體特異性稍弱，但抗體的親和力強(qiáng)，靈敏度高，但易出現(xiàn)非特異性染色（可以通過封閉等避免）。
（2）應(yīng)用范圍的選擇。有的一抗只能用于Westernblotting，或免疫組化、免疫熒光、免疫沉淀等；甚至表明石蠟切片或冰凍切片。
（3）種屬反應(yīng)性的選擇（speciesreactivity）。這一點(diǎn)很重要，表明這種抗體可能存在種屬差異，且這種抗體適合檢測哪種種屬動(dòng)物體內(nèi)的抗原。
（4）種屬來源，一般兔來源的多是多克?。欢∈髞碓吹亩嗍菃慰寺?，但也有另外。根據(jù)此來源來選擇相應(yīng)的二抗。
（5）生產(chǎn)廠家的選擇。如santaCruz公司抗體一般1ml，價(jià)格2100元左右；而chemicon公司一抗一般100ul，價(jià)格2800元左右。這兩個(gè)廠家的同一種抗體它的實(shí)際效價(jià)穩(wěn)定是不同的，我一般用后者抗體做免疫組化效果較好，而前者做Westernblotting效果還可以。
3、在什么情況下使用Triton-X100
（1）TritonX-100化學(xué)名稱為聚乙二醇辛基苯基醚，是一種去污劑。在免疫組織化學(xué)（>10um厚切片）和免疫細(xì)胞化學(xué)中一般用TritonX-100 作為細(xì)胞通透劑，在膜上打孔。
（2）其作用原理：Triton X-100可以溶解細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜、細(xì)胞器膜上的脂質(zhì)而使抗體及大分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進(jìn)入胞漿和胞核內(nèi)，故在細(xì)胞免疫組化時(shí)尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進(jìn)入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。
（3）Triton X-100既是一種表面活性劑，也有抗氧化作用。
4、封閉血清的選擇原則是什么？
（1）膜上或切片上有剩余的位點(diǎn)可以非特異性吸附抗體，造成后續(xù)結(jié)果的假陽性！
（2）封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動(dòng)物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合，否則在后面的步驟中如果和二抗發(fā)生結(jié)合，會(huì)造成背景。
（3）也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來源一致。
5、抗體孵育條件的比較？
（1）一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最佳；孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37度1-2h，而4度過夜和從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min。
（2）二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時(shí)間需要摸索。
6、一抗4度孵育后為什么要進(jìn)行37度復(fù)溫？
（1）一方面，防止切片從4度直接放入PBS易脫片；
（2）另一方面，使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。一般不需要，但對表達(dá)較弱的抗原可能有用，4度和37度時(shí)分子運(yùn)動(dòng)方式不同，前者分子碰撞機(jī)率和運(yùn)動(dòng)速度小于后者，后者結(jié)合更快，但敏感性也提高了并易造成非特異染色。
（3）其實(shí)，我更贊同后一種說法，因?yàn)槲覈L試把肝臟或睪丸片子從4度過夜拿出后，直接用PBS洗沒發(fā)生過脫片現(xiàn)象。事實(shí)勝于雄辯！
7、DAB顯色時(shí)間如何把握？
（1）DAB顯色時(shí)間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)間，到出現(xiàn)淺棕色本底時(shí)即可沖洗；
（2）DAB顯色時(shí)間很短（如幾秒或幾十秒）就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時(shí)間過長，需要下調(diào)抗體濃度或縮短你的抗體孵育時(shí)間；
（3）此外，若很短時(shí)間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長封閉時(shí)間；
（4）DAB顯色時(shí)間很長（如超過十幾分鐘）才出現(xiàn)陽性染色，一方面可能說明你的抗體濃度過低或孵育時(shí)間過短（最好一抗4度過夜）；另一方面就是封閉時(shí)間過長。
8、免疫組化結(jié)果如何分析？
（1）陽性著色細(xì)胞計(jì)數(shù)法。在40*光鏡下，隨機(jī)選擇不重疊的10個(gè)視野，人工或機(jī)器計(jì)數(shù)陽性著色細(xì)胞，每組3~6張不同動(dòng)物組織切片，然后進(jìn)行組間比較即可。
（2）灰密度分析法。通過在不同組別和不同動(dòng)物組織切片上選擇相同區(qū)域、相同條件下用imagej進(jìn)行灰密度分析，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析即可。
（3）評(píng)分法。通過在光學(xué)顯微鏡下對組織切片分別按染色程度（0~3分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色）、陽性范圍進(jìn)行評(píng)分（1~4分為0~25%、26~50%、51~75%、76~100%），最終可以分?jǐn)?shù)相加，再進(jìn)行比較。
對于以上這幾種方法，各有利弊，請細(xì)心選擇。要想得到正確結(jié)果的前提是你要做出著色均勻、背景很淺的高質(zhì)量切片。
9、在什么情況下進(jìn)行組織抗原修復(fù)，抗原修復(fù)的條件是什么？
（1）由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性。通過抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測率。
（2）修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。修復(fù)液也分為若干種（具體的可以查閱相關(guān)資料，大量的：中性的、高pH的等）。
（3）微波修復(fù)，我們一般用6min*4次，效果不錯(cuò)。
10、內(nèi)源性過氧化物酶的滅活時(shí)間和濃度是什么？
（1）一般3%過氧化氫滅活時(shí)間短點(diǎn)，可以10min左右；而0。3%過氧化氫則可以適當(dāng)延長封閉時(shí)間，一般10~30min。
（2）用甲醇配置過氧化氫比雙蒸水或PBS可能好在保護(hù)抗原和固定組織作用，過氧化氫孵育時(shí)間過長易引起脫片。
（3）現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后4度避光保存。
11、如何才能充分脫蠟？
（1）蠟不溶于水，如果脫蠟不干凈，少許蠟存留于切片上，將會(huì)引起染色不均勻、陽性物時(shí)隱時(shí)現(xiàn)、真假難辨、背景染色增加等。為了解決上述的問題，切片在染色前必須徹底脫蠟，目前用于脫蠟的試劑主要是二甲苯，因它脫蠟力強(qiáng)，脫蠟時(shí)間較短；
（2）脫蠟的時(shí)間要根據(jù)季節(jié)，室溫和試劑的新鮮謀面是在不同。如果在夏天，室溫較高，脫蠟試劑也新鮮，則脫蠟時(shí)間不需很多，3-5分鐘就已足夠。如果在冬天，室溫較低，脫蠟試劑也較陳舊，則脫蠟時(shí)間需要延長，10-20分鐘或更長。
（3）當(dāng)天切的切片，燒烤2小時(shí)后進(jìn)行染色，切片帶有溫度進(jìn)行脫蠟這將可加速脫蠟的過程，如果預(yù)先切好烤好的切片，在染色前，還必須對切片進(jìn)行加溫10-20分鐘，然后再行脫蠟，這樣脫蠟速度加快，效果魁偉更好。
總之，操作時(shí)應(yīng)根據(jù)不同的季節(jié)，不同的室溫，不同的試劑來決定，脫蠟的時(shí)間，原則上是要徹底、干凈、完全地脫去切片上的蠟。
12、如何最大限度地降低組織非特異性染色？
（1）縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來控制。這是最重要的一條。
（2）一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。
（3）內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞多的組織），需要通過延長滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來降低背景染色；
（4）非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過延長二抗來源的動(dòng)物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來加強(qiáng)封閉效果；
（5）縮短DAB孵育時(shí)間或降低DAB濃度/過氧化氫濃度等；
（6）適當(dāng)增加PBS沖洗次數(shù)和浸洗時(shí)間，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要；
（7）防止標(biāo)本染色過程中出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。
13、蘇木素復(fù)染時(shí)間的把握？
（1）蘇木素復(fù)染時(shí)間要看當(dāng)時(shí)的室溫、溶液的新舊、目標(biāo)抗原的定位等情況，一般數(shù)秒-數(shù)分鐘。不過這個(gè)如果染色不理想可以補(bǔ)救的。即：染色深則分化時(shí)間稍長些即可；染色淺則再置于蘇木素中染色即可。
（2）鹽酸酒精是分化，氨水是返蘭。作用不同。片子復(fù)染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中數(shù)秒（一定動(dòng)作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蘭即可。
（3）如果分化的顏色過淺，可以復(fù)置于蘇木素中染色。
14、PBS的清洗方式選擇、次數(shù)和時(shí)間的選擇？
（1）單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。
臨床上每天檢測的病例很多，所用的抗體種類及項(xiàng)目也多，如果在加入一抗孵育完后，將它們在一個(gè)缸內(nèi)洗，這樣就會(huì)造成交叉污染，影響最后的結(jié)果。正確的做法是單獨(dú)地進(jìn)行沖洗，沖洗的PBS為一次性，保證切片沒有相互交叉污染的機(jī)會(huì)。
（2）溫柔沖洗，防止切片的脫落。
沖洗切片，取出切片，將PBS從上輕輕地沖洗，讓PBS自上而下流下來，不要拿起切片將PBS對準(zhǔn)切片沖洗，這樣由于沖出的PBS有一定的沖擊力，很容易使切片周邊引起松動(dòng)，導(dǎo)致切片的脫落。
（3）沖洗的時(shí)間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。
沖洗切片有人提出用微振蕩器振染，振下未結(jié)合的各種物，使之不產(chǎn)生背景，此種做法一是浪費(fèi)時(shí)間，二是很容易導(dǎo)致切片的脫落。切片的沖洗據(jù)實(shí)踐認(rèn)為，用一小燒杯柔和地于切片上沖洗，就能徹底沖洗去未結(jié)合的物質(zhì)，無需附加其它條件，沖洗好于切片上再注入PBS，持續(xù)2分鐘左右就完全足夠了。
（4）PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用和要求。
中性及弱鹼性條件（PH7-8）有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解。
（5）常用試劑的配制和使用。
在免疫組織化學(xué)的染色過程中，用得最多的試劑就是緩沖液，因?yàn)榍衅谡麄€(gè)染色中，抗體的加、換、切片的沖洗，DAB的配制都離不開緩沖液?？梢娋彌_液在整個(gè)染色中都起至關(guān)鍵的作用，緩沖液的過酸或偏堿，都將影響染色的結(jié)果。
15、脫片產(chǎn)生的原因和如何防止脫片？
（1）多聚賴氨酸玻片質(zhì)量的問題。我原先是買的，邁新按說也是不錯(cuò)的，可是都脫成什么樣子了。后面補(bǔ)做第二批時(shí)用的病理科老師自己做的片子，要好一點(diǎn)。
（2）組織切的不好，切片機(jī)的問題例如比較老的舊的機(jī)器切的厚或者不均勻，或者切片者手法不好等。
（3）組織的問題，我用的組織癌癥的很多，越是癌癥組織有壞死之類越容易脫。
（4）沒烤好，時(shí)間短溫度不夠之類。
（5）操作的時(shí)候甩的太猛了，有脫片嫌疑的片子最好不甩或輕輕甩，用衛(wèi)生紙從邊緣上慢慢吸水。
（6）修復(fù)的問題：抗原修復(fù)的時(shí)候高壓時(shí)間過長了，或者放進(jìn)100度的修復(fù)液時(shí)手法不好，咚的一聲就丟進(jìn)去了，這樣超容易脫片。此外，用EDTA修復(fù)比檸檬酸容易脫片，但是你要用到EDTA的時(shí)候也沒辦法，只有從另外的問題上著手。
（7）此外，一旦見到有組織漂起來操作就更加要謹(jǐn)慎，用PBS的時(shí)候盡量用泡的，不要沖?；旧习堰@些方面都注意到了，能改善的盡量改善，脫片可以減少很多。
16、背景染色較深的原因有哪些？
（1）抗體濃度過高：一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對其工作濃度進(jìn)行測試，使每一抗體個(gè)體化，找到適合自己實(shí)驗(yàn)室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應(yīng)如此，不能只簡單的按說明書進(jìn)行染色。
（2）抗體孵育時(shí)間過長或溫度較高：解決辦法是，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程，最好隨身佩帶報(bào)時(shí)表或報(bào)時(shí)鐘，及時(shí)提醒，避免因遺忘而造成時(shí)間延長?，F(xiàn)在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時(shí)間不是傳統(tǒng)的1小時(shí)，而是30分鐘，因此，要根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。
（3）DAB變質(zhì)和顯色時(shí)間太長：DAB最好現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣應(yīng)進(jìn)行過濾后再用。配制好的DAB不應(yīng)存放時(shí)間太長，因?yàn)樵跊]有酶的情況下，過氧化氫也會(huì)游離出氧原子與DAB產(chǎn)生反應(yīng)而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB的顯色最好在顯微鏡下監(jiān)控，達(dá)到理想的染色程度時(shí)立即終止反應(yīng)。不過當(dāng)染色片太多時(shí)或用染色機(jī)時(shí)，這樣做似乎不現(xiàn)實(shí)，但至少應(yīng)對一些新的或少用的抗體顯色時(shí)進(jìn)行監(jiān)控，避免顯色時(shí)間過長。
（4）組織變干：修復(fù)液溢出后未及時(shí)補(bǔ)充液體、染色切片太多、動(dòng)作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認(rèn)真仔細(xì)，采用DAKO筆或PAPPen在組織周圍畫圈，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。
（5）切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時(shí)間太長（大于24小時(shí)）：原因上不清楚，但現(xiàn)象存在。有的實(shí)驗(yàn)室喜歡前一天將切片脫蠟至修復(fù)，第二天加抗體進(jìn)行免疫組化染色，如果將裝有切片和修復(fù)液的容器放在4？C冰箱過夜，對結(jié)果無明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會(huì)出現(xiàn)背景著色，因此，不可存放時(shí)間太長。
（6）一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要麼不顯色要麼背景著色。用新買的抗體時(shí)最好設(shè)立陽性對照和用使用過的抗體作比較。
17、蘇木素復(fù)染后氨水返藍(lán)這一步如何做、濃度多少、時(shí)間多長？
答：返藍(lán)可以用堿性溶液（PBS/NA2HPO4/淡氨水）或45度溫水、冷水藍(lán)化均可。一般藍(lán)化5~10min。淡氨水有人用50ml自來水+三四滴的氫氧化銨。
