生物體是一個(gè)高度統(tǒng)一的整體，而細(xì)胞生物學(xué)的主要對象是生物體內(nèi)的各種細(xì)胞，很顯然，在整體條件下研究單個(gè)細(xì)胞或某一細(xì)胞群在體內(nèi)（invivo）的功能活動(dòng)是非常困難的。在實(shí)際工作中，人們常常從生物體內(nèi)取出組織或細(xì)胞，在體外(invitro)模擬體內(nèi)生理環(huán)境，在無菌、適當(dāng)溫度和一定營養(yǎng)條件下，對這些組織或細(xì)胞進(jìn)行孵育培養(yǎng)，使之保持一定的結(jié)構(gòu)和功能，以便于我們的觀察研究，這種方法就是細(xì)胞培養(yǎng)（cellculture）。有時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)也稱為組織培養(yǎng)（tissue culture），二者可作為同義語使用。

細(xì)胞培養(yǎng)的工作始于20世紀(jì)初（Harrison，1907），目前已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。細(xì)胞培養(yǎng)主要具有兩個(gè)方面的優(yōu)點(diǎn)，其一是人工培養(yǎng)條件易于改變并能嚴(yán)格控制，便于研究各種因素對細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能和各種生命活動(dòng)規(guī)律的影響；其二是細(xì)胞在體外培養(yǎng)環(huán)境中可以長期存活和傳代，因此可以比較經(jīng)濟(jì)地、大量地提供在同一時(shí)期、條件相同、性狀相似的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)樣本。
細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)也存在著一定局限性，主要是細(xì)胞離體以后失去與體內(nèi)環(huán)境的密切聯(lián)系，失去了神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和不同細(xì)胞間的相互作用，特定分化基因的表達(dá)減弱或停止，而進(jìn)化中保守的細(xì)胞生長和增殖活動(dòng)卻可維持，遂使體內(nèi)外細(xì)胞出現(xiàn)了差異，這是應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)該注意的問題。
一．細(xì)胞培養(yǎng)的基本知識
（一）培養(yǎng)細(xì)胞的類型及其特點(diǎn)體外培養(yǎng)細(xì)胞大多培養(yǎng)在瓶皿等容器中，根據(jù)它們是否能貼附在支持物上生長的特性，可分為貼附型和懸浮型兩大類。
1．貼附型大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞均為貼附型，它們必須貼附在支持物表面生長，這類細(xì)胞在體內(nèi)時(shí)各自具有其特殊的形態(tài)，但在體外培養(yǎng)時(shí)貼附于支持物后形態(tài)上表現(xiàn)單一化而失去體內(nèi)原有的某些特征，多呈上皮樣或成纖維細(xì)胞樣。
正常貼附型細(xì)胞具有接觸抑制的特性，細(xì)胞相互接觸后可抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，因此細(xì)胞不會(huì)相互重疊于其上面生長。細(xì)胞生長、匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，但只要營養(yǎng)充分，仍可增殖分裂，但當(dāng)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到一定密度后，由于營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，細(xì)胞分裂停止，稱為密度抑制。腫瘤細(xì)胞的接觸抑制及密度抑制往往減弱或消失，因此細(xì)胞可向三維空間發(fā)展，導(dǎo)致細(xì)胞堆積，并可生長至較高的終末細(xì)胞密度。2．懸浮型少數(shù)細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)不貼附于支持物上，而以懸浮狀態(tài)生長，包括一些取自血、脾或骨髓的培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是血液白細(xì)胞，以及一些腫瘤細(xì)胞。細(xì)胞懸浮生長時(shí)可以呈單個(gè)細(xì)胞或細(xì)小的細(xì)胞團(tuán)，胞體為圓形。其優(yōu)點(diǎn)是在培養(yǎng)液中生長，生存空間大，允許長時(shí)間生長，便于大量繁殖。（二）培養(yǎng)細(xì)胞的增殖過程
1．培養(yǎng)細(xì)胞一代的增殖過程培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器，生存空間相對孤立，營養(yǎng)是有限的。當(dāng)細(xì)胞增殖至一定密度后，則需分離出一部分細(xì)胞接種到其他容器，并及時(shí)更新培養(yǎng)液，否則將影響細(xì)胞的繼續(xù)生存，這一過程叫傳代（passage或subculture）。從細(xì)胞接種到下一次傳代再培養(yǎng)的一段時(shí)間叫一代。需要注意的是細(xì)胞培養(yǎng)一代與細(xì)胞倍增（doubling）的概念是不同的，細(xì)胞倍增指的是細(xì)胞數(shù)增加一倍。一般地，細(xì)胞培養(yǎng)一代的過程中，細(xì)胞可倍增2-6次。細(xì)胞傳一代以后，細(xì)胞群體一般要經(jīng)過潛伏期、指數(shù)增長期與平臺(tái)期三個(gè)階段。以貼附型細(xì)胞為例說明如下：細(xì)胞接種后呈懸浮狀態(tài)，在0.5-4h內(nèi)貼附于支持物，進(jìn)入潛伏期，此期細(xì)胞無增殖發(fā)生，原代細(xì)胞持續(xù)約24-96 h，而腫瘤細(xì)胞或無限傳代細(xì)胞僅需6-24h。隨著分裂相細(xì)胞的出現(xiàn)并逐漸增多，細(xì)胞群體進(jìn)入指數(shù)增長期，此期又稱對數(shù)期，細(xì)胞增殖旺盛，成倍增長，活力最佳，適于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究；此期時(shí)間長短因細(xì)胞本身特性及接種密度、血清濃度而不完全相同，一般可持續(xù)3-5天。隨著細(xì)胞數(shù)量的逐漸增多，細(xì)胞相互接觸匯合成片，因接觸抑制及密度抑制細(xì)胞停止分裂繁殖，進(jìn)入平臺(tái)期，細(xì)胞數(shù)目不再增加，但仍維持一定時(shí)間的活力，此時(shí)應(yīng)及時(shí)分離傳代，否則細(xì)胞將因中毒而發(fā)生改變甚至死亡。懸浮型細(xì)胞一般沒有潛伏期，接種并添加新鮮培養(yǎng)液后即可迅速進(jìn)入指數(shù)增長
2．培養(yǎng)細(xì)胞的生命期（life span）培養(yǎng)細(xì)胞的生命期指的是細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時(shí)間，一般可分為原代培養(yǎng)期、傳代期和衰退期。從體內(nèi)取出細(xì)胞接種培養(yǎng)到第一次傳代叫原代培養(yǎng)，一般持續(xù)1-4周。原代細(xì)胞一經(jīng)傳代后便稱為細(xì)胞系（cellline），進(jìn)入傳代期，此期在全生命期中持續(xù)時(shí)間最長，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體的核型。一般情況下可傳代10-50次，隨后細(xì)胞增殖緩慢以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入衰退期，最后死亡。腫瘤細(xì)胞系可無限增殖而無衰退期，正常細(xì)胞系也可在傳代期末期或衰退期發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化，細(xì)胞獲得永生性即永久增殖的能力，稱為無限細(xì)胞系或連續(xù)細(xì)胞系。3．培養(yǎng)細(xì)胞的生存條件培養(yǎng)細(xì)胞需要特定的培養(yǎng)基和培養(yǎng)設(shè)備。
（1）培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞所需營養(yǎng)物質(zhì)與體內(nèi)細(xì)胞相同，包括糖、氨基酸、維生素、無機(jī)離子、微量元素等。細(xì)胞在體外生存于含各種營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基的種類很多，按其物質(zhì)狀態(tài)，分半固體培養(yǎng)基（如軟瓊脂培養(yǎng)基）和液體培養(yǎng)基兩類，其中液體培養(yǎng)基（即培養(yǎng)液）使用最為廣泛。用各種合成培養(yǎng)基配制培養(yǎng)液時(shí)，尚需加一定量的動(dòng)物血清（胎?；蛐∨Ｑ澹?。配制時(shí)根據(jù)添加血清量的多少，構(gòu)成作用不同的培養(yǎng)液，用于不同細(xì)胞和不同研究目的。一般情況下需添加10～20％的血清，以維持細(xì)胞較快的生長增殖速度，稱為生長培養(yǎng)液；為維持細(xì)胞緩慢生長或不死，加2～5％血清含量即可，稱為維持培養(yǎng)液。此外為防止污染，培養(yǎng)液中尚需加一定量的抗生素（多用青霉素100單位/ml和鏈霉素100μg/ml）。（2）細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備培養(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長，浸浴于培養(yǎng)液，并需要特有的環(huán)境，包括一定的溫度、濕度和氣體成分。培養(yǎng)器皿主要有碟和瓶兩類，材質(zhì)為玻璃或塑料，現(xiàn)在使用一次性的塑料培養(yǎng)器皿日益普及。培養(yǎng)環(huán)境通常由CO2恒溫孵育箱提供，恒定地提供37?C溫度、95％濕度和一定量的CO2（通常為5%），CO2可使培養(yǎng)液維持穩(wěn)定的pH。另外，細(xì)胞培養(yǎng)過程中進(jìn)行換液、傳代等工作時(shí)需在無菌工作臺(tái)上進(jìn)行。二．細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)
（一）細(xì)胞分離和原代培養(yǎng)
原代培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng)，指從供體取得組織，分離得到所需細(xì)胞后接種于培養(yǎng)瓶，進(jìn)行首次培養(yǎng)。
培養(yǎng)材料為血液、羊水、胸水和腹水等細(xì)胞懸液時(shí)，可采用低速離心法分離。培養(yǎng)材料為組織塊時(shí)，首先要把組織塊剪切至盡量小，然后用胰蛋白酶或膠原酶消化法使組織進(jìn)一步分散，以獲得細(xì)胞懸液。（二）培養(yǎng)細(xì)胞的傳代
細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶內(nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的過程稱之為傳代；進(jìn)行一次分離培養(yǎng)稱之為傳一代。培養(yǎng)細(xì)胞傳代根據(jù)不同細(xì)胞采取不同的方法。貼壁細(xì)胞的消化傳代多用混合了胰蛋白酶和二乙烯四乙酸二鈉（EDTA）的消化液消化傳代。EDTA能從組織生存環(huán)境中吸取Ca2+、Mg2+，這些離子是維持組織完整的重要因素。消化液使細(xì)胞脫落形成細(xì)胞懸液，然后以合適比例接種在新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。
懸浮細(xì)胞的傳代可直接添加新鮮培養(yǎng)液，或離心收集后換新鮮培養(yǎng)液，以一定比例稀釋傳代。（三）細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇
培養(yǎng)細(xì)胞在傳代中性質(zhì)易發(fā)生改變,有支原體污染的危險(xiǎn)。研究工作也要求細(xì)胞株的代數(shù)應(yīng)維持在一定期限內(nèi)。解決這些困難的方法就是將細(xì)胞凍存，需要的時(shí)候再行復(fù)蘇。凍存前需向培養(yǎng)基中加入保護(hù)劑甘油或二甲基亞砜（DMSO），以減少冰晶對細(xì)胞的損傷。細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的原則是“慢凍快融”。細(xì)胞凍存在液氮中，從理論上講貯存時(shí)間是無限的。（四）細(xì)胞培養(yǎng)微生物污染的檢測
細(xì)胞培養(yǎng)過程中操作不當(dāng)時(shí)，易引發(fā)微生物污染，主要污染微生物為霉菌、細(xì)菌和支原體?？捎枚喾N手段明確污染性質(zhì)，從而從源頭上杜絕污染。然而微生物污染一旦發(fā)生，多數(shù)無法救治。為了防止污染的蔓延，應(yīng)及時(shí)丟棄污染細(xì)胞。體外培養(yǎng)細(xì)胞使用的器材品種較多。由于離體細(xì)胞對各種毒物都很敏感，所以細(xì)胞培養(yǎng)所用器材的清洗、消毒處理是培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵之一。一、玻璃器材
常用的玻璃器材有各種規(guī)格的玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、吸管、離心管等。
無論是初次使用還是培養(yǎng)后重復(fù)使用的玻璃器材均需要進(jìn)行消毒處理。首次使用的玻璃器材應(yīng)先用自來水初步刷洗，然后用稀鹽酸溶液（1%）浸泡過夜，再用自來水沖洗，最后處理方法與重復(fù)使用的器皿的處理。
重復(fù)使用的玻璃器皿的處理步驟：
（1）刷洗。用軟毛刷和優(yōu)質(zhì)中性洗滌劑刷洗，去除器皿內(nèi)外表面的雜質(zhì)。刷洗時(shí)注意不要用力過重，以防損壞器皿內(nèi)表面光潔度，影響細(xì)胞生長；也不能留有死角。器皿數(shù)量大時(shí)，可使用超聲波清潔裝置，沖洗干凈后晾干。
（2）清潔液處理。將刷洗晾干后的玻璃器皿放入硫酸-重鉻鉀清潔液中。清潔液配方如下，見下表：
表 清潔液配方

名稱* 清潔液濃度 25%(弱液) 50%(次強(qiáng)液) 75%(強(qiáng)液) 重鉻酸鉀 1000g 1000g 1000g 濃 硫酸 2500mL 5000mL 7500ML 蒸餾水(或廢液) 7500Ml 5000mL 2500mL

該清潔液具有高度腐蝕性，操作時(shí)必須穿長筒膠靴，戴防酸橡皮手套，圍裙和眼鏡，以防清潔液濺出而灼傷。在配液時(shí)還需注意將酸緩慢放入水中，以防酸遇水放熱產(chǎn)生酸濺出或使玻璃及陶制容器裂開而使清潔液外泄。切勿將水加入酸中，以防酸濺出。常用清潔液為75%和50%兩種。
將玻璃器皿放入時(shí)最好裝入塑料網(wǎng)袋內(nèi)，再浸入清潔液中，玻璃瓶內(nèi)不要?dú)埩魵馀?。一般浸?2~24小時(shí)后取出。在清潔液中取出的器皿先用自來水沖洗10次以上，再用單蒸水沖洗三次以上，最后用雙蒸水（或去離子水）沖洗1~2次，晾干，包裝殺菌。一般用121℃磅高壓蒸氣滅菌20分鐘。玻璃濾器使用后及時(shí)用自來水沖洗濾器表面的剩余物，然后用單蒸水浸泡，除去濾板內(nèi)堵塞雜物，若用濾膜則將濾膜丟棄，加4N鹽酸浸泡12小時(shí)以上，用自來水沖洗，再用單蒸水抽濾2次，雙蒸水(或去離子水)抽濾沖洗、包裝、121℃高壓蒸氣滅菌20分鐘。也可用5%潔消精浸泡20分鐘后，再按上述方法沖洗和滅菌。二、塑料器材
體外培養(yǎng)細(xì)胞中塑料器皿的使用越來越多，有進(jìn)口的，也有國產(chǎn)的。主要有多孔培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶及吸嘴。多孔培養(yǎng)板有4孔、6孔、24孔、96孔等規(guī)格可供選擇。多數(shù)為進(jìn)口產(chǎn)品，已消毒滅菌密封包裝，使用時(shí)只需打開即可。有一次性使用的，也有反復(fù)使用的。在我國不少實(shí)驗(yàn)室，由于經(jīng)費(fèi)有限，經(jīng)過清洗和消毒滅菌再使用的較多。若使用后，先用自來水浸泡沖洗、晾干，再用3%HCl或2%NaOH溶液浸泡過夜，用自來水充分沖洗，或先用2%NaOH處理之后再用3%HCl浸泡30分鐘，最后用自來水沖洗干凈，并用雙蒸水沖洗3次以上，晾干。消毒采用紫外線直接照射或輻照滅菌辦法。清洗時(shí)要防止產(chǎn)生劃痕，以免影響細(xì)胞的貼附性。所以，培養(yǎng)要求較高的細(xì)胞的塑料器材，最好一次性使用。
三、橡皮器材
應(yīng)選擇質(zhì)軟、耐高溫、毒性小的橡皮制品(最好是硅制品)做各種瓶或試管的塞子、蓋子。新購置的橡皮制品，用自來水沖洗去除其表面粉粒和污物。先用5%氫氧化鈉煮沸15分鐘，用自來水沖洗8次，再用4%鹽酸煮沸15分鐘，用自來水沖洗8次，單蒸水沖洗3次，雙蒸水(或去離子水)沖洗一次，晾干后包裝或置于鋁盒內(nèi)，用121℃高壓蒸氣滅菌20分鐘。
已用過的橡皮制品，先用自來水沖洗干凈，然后用洗衣粉加熱煮沸10分鐘后，用自來水邊沖邊用力攪動(dòng)，以充分洗凈殘余洗衣粉，然后用蒸餾水煮沸2次，每次15分鐘，再用單蒸水沖洗2次，必要時(shí)還要用雙蒸水(或去離子水)沖洗一次，晾干后包裝或放于鋁盒內(nèi)，用121℃高壓蒸氣滅菌20分鐘。
四、金屬器材
細(xì)胞培養(yǎng)中需用多種金屬器材，用于解剖、取材、剪切組織及持取物件等，常用的有剪刀、鑷子、手術(shù)刀、解剖刀、血管鉗、組織鑷、眼科鑷及各種型號針頭等。新的金屬器材，先用紙擦去表面的油脂，再用洗衣粉煮沸，或用1%碳酸氫鈉煮沸15分鐘，擦干后再用95%酒精紗布擦干，包裝或置鋁盒內(nèi)于121℃高壓蒸氣滅菌20分鐘。已用過的金屬器材，及時(shí)用酒精棉球擦干凈，包裝入鋁盒內(nèi)于121℃高壓蒸氣滅菌20分鐘。
五、其他物品
紗布先用自來水洗凈后，再用單蒸水沖洗，然后用單蒸水煮沸2次，每次15分鐘，并經(jīng)常用長鑷子翻動(dòng)，再用單蒸水洗2次，晾干后折成八層包裝，用121℃高壓蒸氣滅菌20分鐘。
注射器的針頭使用后，立即用自來水（或來蘇爾水）沖洗數(shù)次，沖洗出針頭內(nèi)的剩余物，以免堵塞針頭，然后用單蒸水洗2~3次，再用95%酒精沖洗3次，包裝或置鋁飯盒內(nèi)121℃高壓蒸氣滅菌20分鐘。
用于細(xì)胞培養(yǎng)過程中的各種人工合成培養(yǎng)液、緩沖液和酶濾液等也需要進(jìn)行除(滅)菌處理。緩沖液常用高壓蒸氣消毒。血清用56℃水浴滅活30分鐘。人工合成培養(yǎng)液等酶溶液用過濾除菌。安裝濾器時(shí)要防止濾膜裝偏而導(dǎo)致過濾失效，過濾時(shí)力量不能過大、過猛，以免濾膜破裂。濾液量多，用抽濾式或加壓式（正壓式）過濾裝置。濾液量少，可選用2.5cm直徑的小號濾器，直接套在小瓶（如青霉素瓶）上，以注射器推動(dòng)壓力過濾。
消毒滅菌前所用的包裝材料可用牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒和特制玻璃（或金屬）消毒筒等，可根據(jù)器材大小、形態(tài)選用，采取局部包裝或部分包裝，并用線繩扎緊。體外細(xì)胞培養(yǎng)過程中使用溶液和培養(yǎng)液的好壞，直接影響到細(xì)胞的生長，配制時(shí)要十分注意。
一、平衡鹽溶液
平衡鹽溶液(balanced saltsolution，BSS)又稱生理鹽水或鹽溶液，是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的基本液體。它主要由無機(jī)鹽和葡萄糖配制而成，起著維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)酸堿度等重要作用。
(一)配液時(shí)的注意事項(xiàng)
（1）需用新鮮的三蒸水或去離子水，按規(guī)定的先后順序配制，稱量要準(zhǔn)確，要看清藥品的規(guī)格、純度、結(jié)晶水的數(shù)量等，切勿搞錯(cuò)。
（2）物質(zhì)的純度純度高的物質(zhì)配制成的溶液質(zhì)量高，因此在配液選用時(shí)要 注意。常用的純度有優(yōu)級純(特級純)，分析純（AR）和化學(xué)純（CD）三種類型。
（3）物質(zhì)的可溶性很多用于培養(yǎng)用液的化學(xué)物質(zhì)都很難溶解，在配制時(shí)必須設(shè)法使其溶解。如磷酸鈣在堿性溶液中幾乎難于溶解，因此在制備磷酸緩沖液時(shí)，需將CaCl2及磷酸氫二鈉單溶后再混合，臨時(shí)用NaHCO3調(diào)pH至弱堿性，以避免沉淀析出。
（4）物質(zhì)的不穩(wěn)定性不少物質(zhì)性質(zhì)不穩(wěn)定，高溫高壓下易破壞。如葡萄糖只能在10磅下維持15～20分鐘，若超磅葡萄糖就會(huì)破壞。
5、貯存液通常先配制成10倍或100倍的一系列母液，用前臨時(shí)混合和稀釋，過濾除菌備用。
(二)幾種常用溶液的配制方法
1、無鈣、鎂、離子溶液(1000ml)
氯化鈉(NaCl)8g磷酸二氫鈉(NaH2PO4H20) 0.05g
氯化鉀(KCl)0.2g碳酸氫鈉(NaHCO3)1g
檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7,H20)1g葡萄糖1g
加去離子水或雙蒸水至1000mL
2、磷酸鹽緩沖液
甲液：0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液
磷酸氫二鈉(無水)28.4g氯化鈉8.77g
加去離子水或雙蒸水至1000mL
乙液：0.2 mol/L磷酸二氫鈉溶液
磷酸二氫鈉(無水)2.4g氯化鈉8.77g
加去離子水或雙蒸水至1000mL
甲、乙液于4℃保存，使用時(shí)按下表所示比例，配制成所需pH濃度，高壓滅菌后室溫保存。表 不同pH濃度所需甲液、乙液量 (mL)

pH* 甲液 乙液 6.0 12.5 87.5 6.2 22 78 6.4 32 68 6.6 45 55 6.8 55 45 7.0 64 36 7.2 72 28 7.4 79 21

3、Hanks液
(1)母液甲(20x)配法
① NaCl(A.R)160g
KCl(A.R)8g
MgSO4.7H2O（A.R) 2g
MgCl.6H2O(A.R) 2g
依次溶于800mL雙蒸水中，前一物質(zhì)溶后再加后一種。
②CaCl2(A.R)2.8g溶于100mL雙蒸水中，溶時(shí)不斷攪拌（此液應(yīng)單配，單溶）。
待上述兩溶液中的“溶質(zhì)”全溶后，將它們混合，再用雙蒸水補(bǔ)至1000mL，向其中加2mL氯仿作為防腐劑，置4℃保存。
(2)母液乙(20×)配法
①Na2HPO4.12H2O(A.R)3.04g
KH2PO4(A.R)1.20g
葡萄糖(A.R)20.0g
溶于800ml雙蒸水中。
②0.4%酚紅液 0.4g酚紅放在玻璃研缽后加0.01NNaOH 11.28mL，直到全部溶解，移入100mL容量瓶中，加水至100mL，過濾，pH為7.4，4℃保存。
待上述各“溶質(zhì)”完全溶解后，用雙蒸水補(bǔ)至1000mL,其中加氯仿2mL作防腐劑，置40℃保存。
(3)使用液（1×）配法
取母液甲和母液乙各一份，加雙蒸水18份，分裝后，塞好瓶塞，掛上標(biāo)志。以115℃高壓滅菌25分鐘(以免葡萄糖破壞)，置室溫后4℃保存，可使用幾個(gè)月。臨用前，用7.5%NaHCO3調(diào)至所需pH。
二、其他溶液
1、pH調(diào)節(jié)液
(1)碳酸氫鈉液可根據(jù)需要與使用方便配制10%以下的各種濃度。先用雙蒸水溶解后，需經(jīng)過濾除菌，分裝小瓶中。亦可使用高壓蒸氣滅菌，密封，4℃冰箱保存。市售有5%～10%濃度的安瓿封裝品，使用也很方便。在調(diào)節(jié)pH過程中或超過要求值時(shí)，可用高壓滅菌的10%醋酸溶液或以CO2調(diào)節(jié)之。
(2)Hepes緩沖液是一種可以保持細(xì)胞培養(yǎng)過程中pH值較長時(shí)間穩(wěn)定的氫離子緩沖劑。通常使用濃度為10～15mmol/L。配制時(shí)，稱取所需的Hepes量，用培養(yǎng)液溶解，用1mmol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，過濾除菌分裝小瓶中，4℃冰箱保存。
2、消化液
(1)胰蛋白酶溶液它是一種黃白色粉末，易受潮，應(yīng)密封放置陰暗干燥處。它的主要作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，從而使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫落并使細(xì)胞游離分散開來。常用濃度為0.25%或5%。如5%胰蛋白酶溶液配制：
稱0.5g粉狀胰蛋白酶，溶于100mL無鈣鎂離子磷酸緩沖液中，置4℃過夜使其溶解，或?qū)⒎Q好的胰蛋白酶放入有刻度的燒杯中，先加入一半的磷酸緩沖液，在杯中放入一長短適宜、外周包有塑料或玻璃外殼的磁力棒，將燒杯放置在帶有控溫和控速的磁力攪拌器上，令磁棒勻速旋轉(zhuǎn)攪拌1-2小時(shí)后，胰蛋白酶充分溶解，用濾紙粗濾后，再用玻璃或塑料濾器過濾除菌，分裝入小瓶，4℃保存，同時(shí)做無菌試驗(yàn)陰性后才能使用。
(2)EDTA(乙烯二胺與乙酸或Versene)溶液EDTA是一種化學(xué)螯合劑，毒性小，對貼壁細(xì)胞有離散作用。一般使用濃度為0.02%。稱0.1gVersene溶解于500mL無鈣鎂離子磷酸緩沖液中，15磅30分鐘高壓滅菌，4℃或室溫保存。
(3)胰蛋白酶—EDTA的配制0.5%胰蛋白酶液96mL，1�TA液4mL，無鈣鎂離子緩沖液100mL。
3、抗生素溶液
為防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)生污染，一般在培養(yǎng)液中加入青霉素鈉鹽和硫酸鏈霉素，其濃度分別為每毫升含100U和100μg。配制時(shí)取青霉素1×106和鏈霉素1×106μg,溶于100mLHanks或PBS中，使其含量為青霉素1×104U/mL，鏈霉素1×104μg/mL，使用時(shí)每100mL培養(yǎng)液中加入0.5~1mL。
4、0.5%臺(tái)盼蘭(Trypan blue)液
稱取臺(tái)盼蘭0.5g，溶于100mL磷酸緩沖液中，溶解后濾紙過濾，室溫保存。
5、0.1%結(jié)晶紫的配制
稱0.1結(jié)晶紫，溶于0.1N的100mL檸檬酸溶液中，(即2.1g檸檬酸加水100mL)，置37℃溶解24小時(shí)，分裝備用。
三、培養(yǎng)基
維持體外培養(yǎng)細(xì)胞生存和生長的液相基質(zhì)，稱細(xì)胞培養(yǎng)基或簡稱培養(yǎng)液。理想的培養(yǎng)液必須具備以下條件：
(1)保持正常細(xì)胞滲透壓及pH緩沖系統(tǒng)。
(2)必須供給細(xì)胞基本營養(yǎng)物，包括細(xì)胞合成代謝、能量代謝及微量元素等。
(3)培養(yǎng)液中沒有毒物或抑制細(xì)胞生長的物質(zhì)。
(4)各種基本成分的量合適，互相之間具有平衡關(guān)系，能精確定量調(diào)整。
(5)容易制成成品，生產(chǎn)簡單，最好能高壓滅菌。
培養(yǎng)基的種類較多，作用略有差別。凡是能供細(xì)胞生長繁殖的培養(yǎng)基稱為生長液。若細(xì)胞生長快，在生長液中維持時(shí)間不長，可從瓶壁脫落下來，或者由于生長密度過大，使顯微鏡觀察困難。為避免此現(xiàn)象的出現(xiàn)，常在細(xì)胞成片后改換成維持液，這種維持液可使細(xì)胞在數(shù)周內(nèi)處于良好的狀態(tài)，特性不變，可隨時(shí)供應(yīng)。此種維持液為無血清或低血清(2%)培養(yǎng)液。如199培養(yǎng)液不加血清就是良好的維持培養(yǎng)基。有時(shí)此種培養(yǎng)基中加入明膠或脫脂乳。還有一種由Smith設(shè)計(jì)的、含有超濾的肝消化物作為維持培養(yǎng)基。
(一)天然培養(yǎng)基(natural medium)
天然培養(yǎng)基主要是取自動(dòng)物體液或從動(dòng)物組織分離提取的物質(zhì)，如血清、雞血漿、雞胚浸出液等。其營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)細(xì)胞有效。最初的體外細(xì)胞培養(yǎng)大多用這種培養(yǎng)基。但由于成分復(fù)雜，個(gè)體差異大，來源有限，又很難標(biāo)準(zhǔn)化，所以實(shí)際工作中，往往是天然培養(yǎng)基結(jié)合在人工培養(yǎng)基中使用。如血清和水解乳蛋白是使用非常廣泛的天然培養(yǎng)基，市場有現(xiàn)成產(chǎn)品出售，不需自制，可省去許多麻煩。
1、血清
血清是全血凝固后分離上清液而得的制品，其除了含有供給細(xì)胞生長所不可缺少的營養(yǎng)成分外，還使細(xì)胞合成DNA，提供細(xì)胞增殖所必須的生長因子。血清的主要成分為蛋白質(zhì)、多肽、激素、氨基酸、葡萄糖、銅酸等。
細(xì)胞培養(yǎng)最常用的是牛血清，除了其營養(yǎng)價(jià)值較其他血清高，還有以下優(yōu)點(diǎn)：
（1）它的胎盤能阻止母體的免疫球蛋白進(jìn)入胎牛而沒有抗體等的抑制效應(yīng)物質(zhì)。
（2）較易獲得。牛血清共分三類：
①小牛血清(calfserum)，取年齡在6個(gè)月，體重達(dá)226kg的小牛放血致死而得。
②新生小牛血清(new born calf serum),出生5天內(nèi)的小牛放血后得。
③胎牛血清(fetal borvineserum)，以無菌手術(shù)剖腹后取胎(210～300天胎齡)，穿刺心臟采血制得。
一般市售血清均為混合血清，有成分互補(bǔ)的優(yōu)點(diǎn)，更適宜于細(xì)胞生長。
購置的血清應(yīng)做熱滅活處理。將小牛血清置于56℃水浴中滅活30分鐘，以破壞補(bǔ)體及一些污染微生物(如病毒、支原體等)，放置4℃冰箱中，無菌試驗(yàn)陰性。未滅活的血清不穩(wěn)定，應(yīng)保存于-20℃冰箱中。
血清雖對細(xì)胞生長極為重要，但其成分復(fù)雜，作用機(jī)制尚未完全了解，加上供血?jiǎng)游锏膫€(gè)體差異，其中有些成分對分析細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)不利，有的甚至對細(xì)胞有害。所以在生長液中血清使用濃度為10%～20%，維持液為2%～3%，有時(shí)根據(jù)培養(yǎng)目的，甚至需要用無血清培養(yǎng)基。
2、水解乳蛋白(hydrolytic albumin)
水解乳蛋白也是一種常用的天然培養(yǎng)基。它是乳蛋白經(jīng)蛋白酶和肽酶混合物水解而得的制品，為一種均勻淡黃色或灰黃色粉末，有潮解性，故常密封保存在陰涼干燥處。其水溶液呈弱酸性，不溶于醇或醚。常用濃度為0.2%～5%，用平衡鹽溶液配制。0.4%濃度的水解乳蛋白經(jīng)分解后幾乎與人血漿中氨基酸成分相當(dāng)。在此培養(yǎng)基中再加入血清，可培養(yǎng)很多種細(xì)胞。市售產(chǎn)品每批都有差別，應(yīng)先預(yù)試。
0.5%水解乳蛋白的配制：稱取0.5g水解乳蛋白粉末，用少許滅菌的Hanks液調(diào)成糊狀，再補(bǔ)充Hanks液至100mL，待充分溶解(室溫置1~2h)后，粗濾分裝，以115℃20分鐘高壓蒸汽滅菌，無菌試驗(yàn)陰性，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>3、酵母浸出液
該液在無血清蛋白存在時(shí)可促使細(xì)胞增殖。酵母浸出物中有幾種結(jié)合蛋白的物質(zhì)對增加細(xì)胞的生長率特別有利。它還含有豐富的維生素，故天然培養(yǎng)基中也常加有酵母浸出物成分，常用濃度為0.1%。
4、雞胚浸出液
雞胚浸出液含有生長因子、大分子核蛋白和小分子氨基酸等，可刺激細(xì)胞生長增殖，幾乎各種組織細(xì)胞培養(yǎng)物都可使用。常用濃度不能超過30%。近幾年，由于培養(yǎng)基的廣泛使用，雞胚浸出液的使用已大為減少。
雞胚浸出液的制備：取孵育10～20天的雞胚，用洗液洗三次后剪碎或攪拌后加入Hanks液并攪均勻，注意氣囊、膜囊和尿囊膜必須剝離去除。置室溫或在37℃下孵育30分鐘或更長時(shí)間，并采取凍融方法以助析出浸出液。2000r/min離心沉淀20分鐘，取出上清，作無菌試驗(yàn)陰性，加雙抗；分裝后低溫保存，也可采用過濾法除菌。
5、雞血漿
雞血漿含有纖維蛋白原和其他一些營養(yǎng)成分，是使用最早的天然培養(yǎng)基。缺點(diǎn)是易于液化，故很少單獨(dú)使用。
雞血漿制備：在無菌條件下配制0.2%生理鹽水肝素液，115℃20分鐘高壓滅菌或過濾除菌，分裝入小瓶。取消毒過的干燥注射器先吸少許肝素，濕潤針管內(nèi)壁，選擇年幼的雞，從翼靜脈采血。3000r/min 離心10分鐘,分裝入小瓶,于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>6、胰酶消化牛心肌浸液
該浸液主要用作支原體檢查。制備方法如下：
（1）新鮮牛心用蒸餾水洗兩次，切開除去內(nèi)膜、脂肪及結(jié)締組織等，用絞肉機(jī)將心肌絞碎，稱取250g加雙蒸水900mL，加NaCl5g，放入三角燒瓶內(nèi)。
（2）56℃水溶加溫10～20分鐘，再加入胰酶2.5g，待胰酶全部溶解后用NaoH調(diào)節(jié)pH至8.0，以增強(qiáng)消化能力，于56℃消化2小時(shí)，并不斷攪拌，保持pH8.0左右。
（3）將心肌消化懸液用HCl調(diào)至pH6.0左右，煮沸5-10分鐘，再用四層紗布濾去肉渣，略加壓力將肉汁擠出，將浸出液加雙蒸水至1000mL。
（4）加酵母浸膏1g攪拌之，調(diào)pH至8.0再煮5分鐘，四層紗布（中間墊一層脫脂棉）過濾，再用cp濾紙過濾，pH保持在8.0，即成牛的心肌浸液，115℃15分鐘高壓滅菌，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>(二)人工合成培養(yǎng)基
天然培養(yǎng)基的來源是有限的，要進(jìn)行大量體外細(xì)胞培養(yǎng)，需要選用人工合成的各種化學(xué)物質(zhì)配制而成的、又利于細(xì)胞生長的培養(yǎng)基。1950年，Morgan提出了包括69種成分的199配方，開始了人工合成培養(yǎng)基的歷史，它是在平衡鹽溶液中加入標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)營養(yǎng)物質(zhì)而構(gòu)成的培養(yǎng)基。隨著生物化學(xué)的飛躍發(fā)展，人們不斷應(yīng)用生化提純或人工合成的各種化學(xué)物質(zhì)設(shè)計(jì)出許多種合成培養(yǎng)基的配方，企圖找到最有利于組織細(xì)胞生長的培養(yǎng)液，如199，Eagle、RPMI1640、HAMF12、NCT109等。
1、人工合成培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)
人工合成培養(yǎng)基具有以下優(yōu)點(diǎn)：
（1）人工培養(yǎng)基是用已知成分配制，培養(yǎng)條件一致。
（2）它可以精密地測定培養(yǎng)的細(xì)胞與培養(yǎng)液內(nèi)物質(zhì)變化的情況，用生化定量的方法可以分析各種組織以及各種實(shí)驗(yàn)條件下不同組織細(xì)胞的生長和代謝，這也可提供和篩選更加有利于細(xì)胞生長的更趨簡化的培養(yǎng)基。
（3）用人工培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞比較透明清楚，胞漿內(nèi)的顆粒很少，換液時(shí)間可適當(dāng)延長，從而節(jié)省人力、物力。
（4）人工合成培養(yǎng)基克服了天然培養(yǎng)基中可能潛在病毒污染的缺點(diǎn)，有利于培養(yǎng)和研究病毒。
（5）培養(yǎng)基成分便于儲(chǔ)存和大量配制，便于細(xì)胞大量生產(chǎn)。2、人工合成培養(yǎng)基的成分
人工合成培養(yǎng)基的主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機(jī)離子及其他一些輔助物質(zhì)。這些營養(yǎng)物質(zhì)的主要作用見前一章。
隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，人工合成培養(yǎng)基不僅品種增加，配方相對固定，并形成配制好的干粉型商品，而且培養(yǎng)基成分趨于簡單化?，F(xiàn)今市售的Eagle、RPMI1640和DMEM等培養(yǎng)液比以前已有了較大改進(jìn)，增減了一些成分，以滿足細(xì)胞培養(yǎng)中新技術(shù)的需要。如雜交瘤技術(shù)中常用的DMEM培養(yǎng)基，使用時(shí)需補(bǔ)加丙酮酸鈉和2-硫基乙醇（2-mercaptoethanol,2-Me），以促進(jìn)分裂原的反應(yīng)和DNA合成，增加細(xì)胞轉(zhuǎn)化。2-Me常配制成0.1mol/L的貯存液，用時(shí)每升培養(yǎng)液加0.5mL。PHA有市售的商品。
3、幾種常用人工合成培養(yǎng)基的配制
(1)RPMI1640培養(yǎng)液稱10.4g粉末(市售進(jìn)口產(chǎn)品一般為一包)，溶于1000mL三蒸水中，待溶解后通入CO2約5分鐘，至液體呈檸檬色后加入0.3g/L谷氨酰胺，或先用1N HCl調(diào)至pH6.8以下，后用1 NNaOH調(diào)至pH7.2～pH7.4；用無菌玻璃濾器或金屬濾器0.22μm或0.3μm微孔濾膜過濾除菌，按所需量分裝,置低溫保存。
(2)Eagle基礎(chǔ)培養(yǎng)基稱9.4g粉末(一小包)加入1000mL三蒸水中，待完全溶解后采用121℃高壓蒸氣滅菌15分鐘，臨用前按比例加入谷氨酰胺，并用10%NaHCO312.5mL～22mL(或通入CO2)，調(diào)pH7.２～pH7.4，過濾除菌，低溫保存。
(3)生長培養(yǎng)液根據(jù)各種細(xì)胞培養(yǎng)的需要，在配制人工合成培養(yǎng)基時(shí)，尚需加入一定量的天然合成培養(yǎng)液，構(gòu)成最適合細(xì)胞生長的培養(yǎng)液，加入適量血清的生長液就是其中的一種。這種培養(yǎng)液主要為細(xì)胞生長增殖之用，所含血清比例較大。一般配法：基本培養(yǎng)基80%～90%，小牛血清10%～20%，并加雙抗生素(青霉素100U/mL，鏈霉素100μg/ml)，上述比例如有特定需要，可根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)要求進(jìn)行增減。
(4)維持液這也是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上配制的細(xì)胞培養(yǎng)用液，主要作用是維持細(xì)胞緩慢生長而不死。一般血清含量較少，通常基本培養(yǎng)基為97%～98%，小牛血清3%～2%。
(5)無血清培養(yǎng)基因血清所含成分復(fù)雜，同時(shí)也含有一些不可控因素，細(xì)胞毒性物質(zhì)和抑制物，不僅影響細(xì)胞生長和細(xì)胞某些功能的表達(dá)，有的還會(huì)對細(xì)胞產(chǎn)生去分化作用，影響一些基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究的結(jié)果。因此，一些技術(shù)要求和研究目的較高的細(xì)胞培養(yǎng)，如細(xì)胞生長因子研究和制備、單克隆抗體制備、細(xì)胞分泌產(chǎn)物的研究和制備等，都須用無血清培養(yǎng)基，以減少或去除異種蛋白及干擾因素。不僅對產(chǎn)品純化提取有益，而且可避免異種血清所引起的過敏反應(yīng)。
無血清培養(yǎng)基主要有基礎(chǔ)培養(yǎng)基和輔加成分組成，基礎(chǔ)培養(yǎng)基一般用人工合成培養(yǎng)基，最常用的是HamF12和DMEM培養(yǎng)基1:1混合。然后補(bǔ)加15mmol/LHepes1.2g/mL，NaHCO3作為基礎(chǔ)溶液。輔加成分有：
①促貼壁附著成分，如纖維粘連蛋白，層粘連蛋白膠原等。
②促生長增殖成分，如 一些生長因子和激素。
③蛋白酶抑制物，如 大豆胰蛋白酶抑制劑（Soybeantrypsin inhibitor）。
這些輔加成分根據(jù)細(xì)胞生長條件和實(shí)驗(yàn)要求添加。一般先配好儲(chǔ)存液，過濾除菌，低溫保存，要避免反復(fù)凍融。使用濃度和使用方法各不相同。如纖維粘連蛋白的配制濃度為25mg～50mg/L，用時(shí)先涂在培養(yǎng)瓶皿支持物上；層粘連蛋白1mg～5mg/L，可直接加在培養(yǎng)液中。成纖維細(xì)胞生長因子配制濃度2mg/L，使用濃度5μg/L，可直接加入培養(yǎng)液中；大豆胰蛋白酶抑制劑，使用濃度為0.1%～0.5%，通常配制在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中。

人和動(dòng)物體內(nèi)絕大部分組織都可以在體外培養(yǎng)，但其難易程度與組織類型、分化程度、供體的年齡、元代培養(yǎng)方法等有直接關(guān)系，元代取材是進(jìn)行組織培養(yǎng)的第一步。

取材的基本要求

（1）卻才的組織最好盡快培養(yǎng)。因故不能即使培養(yǎng)，可將組織浸泡于培養(yǎng)業(yè)內(nèi)，放置于冰浴或4度冰箱中。如果組織塊很大，應(yīng)先將其切成1cm3以下的小塊再低溫保存，但時(shí)間不能超過24h。

（2）取材時(shí)應(yīng)嚴(yán)格無菌操作，用無菌包裝的器皿或用事先消毒好的，帶少許培養(yǎng)液的小瓶等便于攜帶的物品取材，取材過程中要盡量避免紫外線照射和接觸化學(xué)試劑如碘、汞等。從消化道、周圍有壞死組織等污染因素存在的區(qū)域取材時(shí)，為減少污染，可用含500~1000單位/ml的青,鏈霉素BSS液漂洗5~10min,或用10%達(dá)克寧注射液沖洗浸泡10min再做培養(yǎng).

(3)取材和原代培養(yǎng)時(shí),要用鋒利的器械如刮臉刀片切碎組織,盡可能減少對細(xì)胞的機(jī)械損傷.

(4)對于血液.脂肪.神經(jīng)組織.結(jié)締組織和壞死組織,取材時(shí)要細(xì)心出去,修剪和切碎過程中,為避免組織干燥,可將其浸泡于少量培養(yǎng)液中.

(5)原代培養(yǎng),特別是正常細(xì)胞的培養(yǎng),應(yīng)采用營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)液,最好添加胎牛血清,含量為10%~20%為宜.

(6)一般來講,胚胎組織較成熟個(gè)體的組織容易培養(yǎng),分化底的較分化高的組織容易生長,腫瘤組織較正常組織容易培養(yǎng).如無特殊要求,可采用易培養(yǎng)的組織進(jìn)行培養(yǎng),成功率較高.

(7)為了便于以后鑒別原代組織的來源和觀察細(xì)胞體外培養(yǎng)后與原組織的差異性,原代取材時(shí)要同時(shí)留好組織學(xué)標(biāo)本和電鏡標(biāo)本.對組織的來源.部位.包括供體的一般情況要做詳細(xì)的記錄,以備以后查詢.

取材的基本器材和用品

(1)眼科組織剪.彎鑷.手術(shù)刀(用前消毒)

(2)裝有無血清培養(yǎng)基或Hank's液的小瓶

(3)小燒杯(10ml,50ml)

(4)培養(yǎng)皿(特殊用途物品詳見后面章節(jié))

皮膚和粘膜的取材

皮膚和粘膜是上皮細(xì)胞培養(yǎng)的重要組織來源.一般皮膚黏膜主要取自手術(shù)過程中切除的部分組織,如特殊需要也可酌情單獨(dú)取材.方法似外科取斷層皮片手術(shù)的操作,但面積一般2~3mm2即可.這樣局部不留疤痕.注意取材時(shí)不要用碘酒消毒.

皮膚黏膜培養(yǎng)多是以獲取上皮細(xì)胞為目的,因而無論何種方法取材都不要切取太厚并要盡可能去除所攜帶的皮下或者黏膜下組織.如欲培養(yǎng)成纖維細(xì)胞則反之,皮膚.粘膜分布在機(jī)體外部或與外界相通的部位,故表面細(xì)菌.霉菌很多.取材時(shí)要嚴(yán)格消毒,必要時(shí)用較高濃度的抗菌素溶液漂洗.

內(nèi)臟和實(shí)體瘤的取材

人和動(dòng)物體內(nèi)所發(fā)生的腫瘤及各臟器是較常用的培養(yǎng)材料.內(nèi)臟除消化道外基本是無菌的,但有些實(shí)體瘤有壞死并向外破潰者可能被細(xì)菌污染.內(nèi)臟和實(shí)體瘤取材時(shí),一定要明確和熟悉自己所需要組織的類型和部位,要去除不需要的部分如血管.神經(jīng)和組織間的結(jié)締組織,取腫瘤組織時(shí)要盡可能取腫瘤細(xì)胞分布較多的部分,避開壞死液化部分.但有些復(fù)發(fā)性.浸潤性較強(qiáng)的腫瘤較難取到較為純凈的瘤體組織,其腫瘤組織與結(jié)締組織混雜在一起,培養(yǎng)后會(huì)有很多纖維細(xì)胞生長,給以后的培養(yǎng)工作增加困難.對于一些特殊細(xì)胞培養(yǎng)的取材,詳見后面的有關(guān)章節(jié).

血細(xì)胞的取材

血液中的白細(xì)胞是很常用的培養(yǎng)材料,常用于進(jìn)行染色體分析.淋巴細(xì)胞體外激活進(jìn)行免疫治療等.一般多采用靜脈取血,微量時(shí)也可以從指尖或耳垂取血.為防止凝血重用肝素抗凝劑,抗凝劑的量以產(chǎn)生抗凝效果的最小量為宜,量過大易導(dǎo)致溶血.肝素常用濃度為20U/ml,抽血前針管也要用濃度較高的肝素(500U/ml)濕潤.抽血時(shí)要嚴(yán)格無菌.

骨髓.羊水.胸水.腹水內(nèi)細(xì)胞的取材

要根據(jù)各種有關(guān)操作規(guī)程進(jìn)行.詳見以后的章節(jié).這幾種樣品取材后一般不需要其它處理,離心后最好立即培養(yǎng),不易低溫保存.

鼠胚組織的取材

由于鼠胚組織取材方便,易于培養(yǎng),同時(shí)與人類相近都是哺乳類動(dòng)物,已成為較常用的培養(yǎng)材料.因?yàn)樾∈蟮拿须[藏微生物較多,而且不易消毒.所以取材時(shí)更要注意無菌消毒,其無菌消毒一般采用以下方法進(jìn)行:首先用引頸法殺死動(dòng)物,然后將其整個(gè)浸入盛有75%酒精的燒杯中5min,注意時(shí)間不能太長以免酒精從口和其它孔道進(jìn)入體內(nèi),影響組織活力.取出后放在消毒過的小木板上,用消毒過的圖釘或大頭釘將其固定.然后用眼科剪和止血鉗剪開皮膚解剖取材.也可在酒精消毒后,在動(dòng)物軀干中部環(huán)形剪開皮膚,用止血鉗分別挾住兩側(cè)皮膚拉向頭尾把動(dòng)物反包,暴露軀干,然后在固定解剖取材.區(qū)號的組織要放置在另一干凈的平皿中或玻璃板上進(jìn)行原代培養(yǎng)操作.動(dòng)物消毒后的操作宜在超凈臺(tái)內(nèi)或無菌環(huán)境中進(jìn)行。

細(xì)胞培養(yǎng)的必備設(shè)施

根據(jù)體外培養(yǎng)細(xì)胞生長特點(diǎn)和條件，擁有一個(gè)無菌實(shí)驗(yàn)室、一臺(tái)超凈工作臺(tái)和一個(gè)恒溫培養(yǎng)箱是細(xì)胞培養(yǎng)的三大必備設(shè)施。 一、無菌實(shí)驗(yàn)室 無菌實(shí)驗(yàn)室或操作室的設(shè)計(jì)原則是，有防止微生物污染和有害因素的影響措施，要求工作環(huán)境清潔、空氣清新、干燥和無煙塵。無菌實(shí)驗(yàn)室最好能單獨(dú)設(shè)置。如果條件有限，只能限制在一個(gè)大實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，應(yīng)劃分不同的功能區(qū)或用鋁合金隔板隔開，將無菌操作室與清洗、消毒滅菌區(qū)、制備、儲(chǔ)藏和孵育區(qū)分開。 無菌操作區(qū)只限于細(xì)胞培養(yǎng)及其他無菌操作的區(qū)域。亦可把凈化工作臺(tái)置于操作室中，這樣更為安全。此室最好能與外界隔離，不能穿行或受其他因素干擾。操作室的大小依需要而定，一般由更衣間、緩沖間和操作間三部分組成。更衣間放在外，主要供更換衣帽、鞋子等。緩沖間位于更衣間與操作間之間，也可同時(shí)和幾個(gè)操作間相通。操作間放在內(nèi)間，主要供無菌操作和細(xì)胞培養(yǎng)，房間應(yīng)不受日光直射，大小適當(dāng)，高度適宜(2.5m)。房間過大，清掃和消毒不便；過小，操作不便；頂部過高會(huì)影響紫外線的有效滅菌效果。墻壁應(yīng)光滑無死角，以便清洗和消毒。工作臺(tái)不應(yīng)緊靠墻壁放置，臺(tái)面漆成白色或灰色，以利于解剖組織及酚紅顯示pH的觀察。若能購置超凈工作臺(tái)則更好。無菌操作間應(yīng)為密閉式，設(shè)置空氣消毒用的紫外線燈、空氣過濾凈化器和恒溫裝置。如果條件有限，僅做一般要求的細(xì)胞培養(yǎng)，在相對狹小的空間內(nèi)，只設(shè)置凈化臺(tái)而不設(shè)操作室。但要注意季節(jié)氣候環(huán)境的影響和注意無菌操作環(huán)節(jié)。做要求較高的細(xì)胞培養(yǎng)，最好設(shè)置無菌操作室，有條件的應(yīng)設(shè)凈化工作室，以避免季節(jié)影響和杜絕污染。 二、凈化工作臺(tái) 也稱超凈工作臺(tái)。目前大多數(shù)從事細(xì)胞培養(yǎng)工作的實(shí)驗(yàn)室都已裝備了超凈工作臺(tái)。這種工作臺(tái)占據(jù)空間小，安裝方便，操作簡單，投資少，效果不比無菌操作室差，即使不設(shè)置單獨(dú)的無菌實(shí)驗(yàn)室，只要購置安裝了超凈工作臺(tái)，也能進(jìn)行簡單的細(xì)胞培養(yǎng)工作。 超凈工作臺(tái)種類繁多，但主要有三大類：一類是測流式；第二類為流直式；第三類為外流式，或稱為水平層流式。它們的基本工作原理大同小異：內(nèi)設(shè)鼓風(fēng)機(jī)，驅(qū)動(dòng)空氣通過高效濾器過濾凈化后，讓凈化空氣徐徐通過臺(tái)面空間，使操作區(qū)構(gòu)成無菌環(huán)境。它們的區(qū)別在于氣流的方向不同，側(cè)流式即凈化后氣流由左側(cè)或右側(cè)通過臺(tái)面流向?qū)?cè)；直流式為氣流從上向下或從下向上流動(dòng)；外流式為氣流向操作者方向吹來。這三類工作臺(tái)各有利弊。側(cè)流式和直流式能形成氣流屏而保持操作臺(tái)無菌，但在凈化氣流和外界氣體交界處可因氣流的流動(dòng)形成負(fù)壓，使少許未凈化氣體混入，有可能發(fā)生污染，尤其在多雨季節(jié)的南方，會(huì)增加污染機(jī)會(huì)。外流式工作臺(tái)因氣流面向操作者流動(dòng)，外方氣流不易混入，但在做有害實(shí)驗(yàn)時(shí)，對操作者健康不利。使用此類工作臺(tái)一般可用有機(jī)玻璃將上半部遮擋，讓氣流從下方通過，以盡量減少其不利影響?，F(xiàn)在很多實(shí)驗(yàn)室普遍使用的側(cè)流式工作臺(tái),是一種封閉式的工作臺(tái),兩個(gè)側(cè)面各留兩個(gè)圓洞，供操作者手臂伸入進(jìn)行操作，污染機(jī)會(huì)極少。但要拿取較大物品或進(jìn)行較大范圍的操作就不夠方便。 超凈工作臺(tái)作為一種設(shè)備也需要維護(hù)和保養(yǎng)，才能延長其使用壽命。一般應(yīng)注意以下幾點(diǎn)： （1）超凈工作臺(tái)一般宜安裝在避免日光直射、清潔無塵的房間內(nèi)。若能放在無菌操作區(qū)內(nèi)則更佳，不僅效果好，而且濾器（料）的使用壽命長。 （2）久未使用的工作臺(tái)在使用前應(yīng)進(jìn)行徹底清洗、消毒滅菌。用1:1000的來蘇兒或75%的酒精擦洗臺(tái)面，濾器械的灰塵可用真空吸塵器清除。停止使用時(shí)最好用作防塵布或塑料布套好，避免灰塵積聚。 （3）凈化工作臺(tái)內(nèi)不應(yīng)放置其他與細(xì)胞培養(yǎng)無關(guān)的用品，更不能用作儲(chǔ)存室。每次使用前半小時(shí)先開紫外線燈滅菌，再關(guān)滅菌燈啟動(dòng)風(fēng)機(jī)，然后進(jìn)行培養(yǎng)操作。 （4）不設(shè)在無菌操作區(qū)內(nèi)經(jīng)常使用的凈化臺(tái)，要注意過濾器的效果。一般2~3年更換一次，3~6個(gè)月拆下清洗一次，以保持過濾器的凈化效果。 三、恒溫培養(yǎng)箱 用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)箱分變通電熱恒溫培養(yǎng)箱和CO2培養(yǎng)箱。溫控變化一般不超過±0.5℃,最適溫度為37℃。因此要求培養(yǎng)箱具有較高的靈敏度?？販匮b置的優(yōu)劣是電熱恒溫箱質(zhì)量的關(guān)鍵，選購時(shí)一定要注意。一般選購隔水式或晶體管式控溫培養(yǎng)箱，適用于封閉式的培養(yǎng)。 CO2培養(yǎng)箱在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室已得到普通的使用。它能提供較為恒定的CO2，通常為5%，使培養(yǎng)液的pH保持穩(wěn)定，適用于開放式或半開放式的培養(yǎng)。需要注意的是：為了避免污染，要對培養(yǎng)箱定期進(jìn)行消毒，如有紫外燈則用紫外線消毒，如無紫外燈須用酒精定期擦試消毒。另外，要維持箱內(nèi)溫度、濕度的恒定，可用無菌蒸餾水定期注入外箱內(nèi)，或用無菌潮濕的紗布置于托盤內(nèi)，然后將培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板置于上面，再放入CO2培養(yǎng)箱，以保持濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)而影響細(xì)胞生長。 四、其他設(shè)備 進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)除了上述三大設(shè)備外，還需配備電熱干燥箱、冰箱、水純化裝置、普通光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡、細(xì)胞液氮儲(chǔ)存器、離心機(jī)、消毒器、抽濾裝置等。 電熱干燥箱：主要用于烘干熱消毒玻璃器皿，也可用于干熱消毒。在用于干熱消毒時(shí)，溫度一般要求達(dá)到160℃(滅菌)或180℃(去除熱原)，消毒時(shí)間須在2h以上。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室常用的干燥箱為鼓風(fēng)式電熱干燥箱（規(guī)格為5605mm×500mm×500mm），雖然升溫較慢，但溫度均勻，效果較好。鼓風(fēng)與升溫同時(shí)開始，待溫度達(dá)100℃后再打開，以避免玻璃器皿突然遇冷而炸裂損壞。金屬解剖器械、塑料制品、橡膠制品等不能放在干燥箱內(nèi)滅菌。 冰箱：一般用雙門冰箱，既有4℃左右的冷藏區(qū)，又有-20℃以下的冷凍區(qū)。如條件許可，應(yīng)有一臺(tái)普通冷藏冰箱和一臺(tái)低溫冰箱（<-70℃）。前者主要用于儲(chǔ)存培養(yǎng)液、生理鹽水、Hanks液、試劑等培養(yǎng)用的物品和短期保存的組織標(biāo)本。后者用于保存需較長時(shí)間存放的制劑，如酶、血清和組織標(biāo)本等。冰箱應(yīng)保持清潔，防止污染。禁止存放有毒、易燃、易揮發(fā)物品。 顯微鏡：應(yīng)有一臺(tái)普通顯微鏡和一臺(tái)倒置顯微鏡。前者用于細(xì)胞計(jì)數(shù)和一般觀察，后者用于觀察細(xì)胞的生長情況和有無污染。若條件許可，應(yīng)配置照相系統(tǒng)和熒光顯微鏡。 水純化裝置：這也是細(xì)胞培養(yǎng)不可缺少的設(shè)備。因?yàn)轶w外培養(yǎng)細(xì)胞對水的要求較高，無論是細(xì)胞培養(yǎng)液還是配試劑等都應(yīng)使用兩次以上蒸餾的雙蒸水。離子交換裝置處理的水因?yàn)椴荒芡耆コ袡C(jī)物而極少應(yīng)用。外售蒸餾水常用金屬器蒸餾，易混入金屬離子，須用玻璃蒸餾器重新蒸餾一次后才能使用。目前國內(nèi)普通使用的是自動(dòng)雙重純水蒸餾器(碳管加熱)，較為安全、方便、蒸餾速度也較快，但不宜直接用自來水蒸餾。配制培養(yǎng)液的水應(yīng)用配液前蒸餾的新鮮三蒸水。 細(xì)胞冷凍貯存器：主要是液氮容器。國產(chǎn)的能滿足要求。容積大小根據(jù)實(shí)驗(yàn)室需求選購。一般小實(shí)驗(yàn)室用35L3的，大實(shí)驗(yàn)室，多可購50L3的。窄頸瓶維持液氮時(shí)間長（1月左右），但存取不方便。寬頸瓶存取方便，但維持液氮時(shí)間短（7~10天）。定期加液氮的時(shí)間可據(jù)此來確定。由于液氮溫度達(dá)-196℃，使用時(shí)要防止凍傷手。 離心機(jī)：一般應(yīng)配有普通離心機(jī)，最好應(yīng)配置高速冷凍離心機(jī)。普通離心機(jī)轉(zhuǎn)速在4000r/min以下，臺(tái)式的就可滿足要求。用于制備細(xì)胞懸液、漂洗、分離細(xì)胞。若開展細(xì)胞脫核、DNA和RNA抽提、組織勻漿等研究，需使用高速、大容量和能進(jìn)行調(diào)溫的離心機(jī)。 清毒器：一般常用小型手提式高壓蒸氣消毒器。它可用于無法干熱高溫烘烤消毒的各種塑料培養(yǎng)用品、橡膠制品等的消毒。 抽濾裝置：玻璃濾器和金屬濾器。濾器中的濾膜一般用0.2～0.3μm孔徑的微孔濾膜。凡在高溫或射線下易發(fā)生變性或失去功能的物質(zhì)，如人工合成培養(yǎng)液、血清、消化用胰酶等都須用濾器過濾除菌。

細(xì)胞培養(yǎng)現(xiàn)在不局限于對細(xì)胞簡單的培養(yǎng)使用，越來越多的研究向深處，比如研究細(xì)胞長時(shí)間生長的過程，對細(xì)胞進(jìn)行電刺激會(huì)有何影響？？或是灌流藥物對比分析細(xì)胞的不同變化?等等，這些必然要面對的一個(gè)問題：什么產(chǎn)品能夠提供上述實(shí)驗(yàn)的成功進(jìn)行？我想現(xiàn)在正在流行的活細(xì)胞培養(yǎng)裝置則實(shí)現(xiàn)了研究人的夢想！！

本文主要介紹一下你要完成上述實(shí)驗(yàn)?zāi)惚仨毦邆淠男┡渲?？？和主流的活?xì)胞培養(yǎng)裝置有哪些？？一活細(xì)胞培養(yǎng)具備的配置任何生物組織的觀察當(dāng)然離不開顯微鏡的存在，倒置顯微是必須的。如果你僅是觀察，那么加上活細(xì)胞培養(yǎng)裝置（咨詢廠家）即OK了（當(dāng)然細(xì)胞的前期培養(yǎng)所需要的溶劑，工作臺(tái)啊等參考1-5的文章），最后做了實(shí)驗(yàn)，不拍照感覺不過癮，那就裝個(gè)CCD好了?？瓷先ズ唵瘟伺?！二主流的活細(xì)胞培養(yǎng)裝置1PeConPeCon專為活細(xì)胞顯微鏡工作者提供產(chǎn)品，他們?yōu)樘囟ㄐ吞柡推放频娘@微鏡設(shè)計(jì)合適的產(chǎn)品，包括加熱和制冷、二氧化碳、氧氣、蒸發(fā)的控制設(shè)備，是一家德國公司。2 Live Cell instrument(LCI) LCI是一家專業(yè)從事活細(xì)胞培養(yǎng)裝置設(shè)計(jì)、研發(fā)和生產(chǎn)的公司，公司的產(chǎn)品采用磁吸式組配專利方案設(shè)計(jì)，取代了傳統(tǒng)一次性培養(yǎng)皿的浪費(fèi)，組裝簡單，不會(huì)擠壓玻片，損傷細(xì)胞，具有TC,WP,IC三大系列，客服了一臺(tái)培養(yǎng)裝置標(biāo)配一臺(tái)顯微鏡的困境，LCI一套系統(tǒng)可以適用于幾乎任何顯微鏡的使用。3 WarnerInstrumentsWarner Instruments是HarvardApparatus的成員之一，給生命科學(xué)研究者提供大量設(shè)備和附件。他們設(shè)計(jì)制造的產(chǎn)品包括各種培養(yǎng)箱和培養(yǎng)系統(tǒng)，都可以用于活細(xì)胞成像。4 WillCoWellsWillCoWells公司位于荷蘭，是醫(yī)學(xué)和實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)品制造商。公司供應(yīng)專為組織培養(yǎng)設(shè)計(jì)的玻璃底培養(yǎng)皿，這些培養(yǎng)皿可由格柵，或在玻璃的外表面上附有氧化銦膜。5 Life ImagingServices主要提供活細(xì)胞顯微鏡相關(guān)設(shè)備，包括數(shù)據(jù)的展示。Ludin成像培養(yǎng)室和顯微鏡溫度控制系統(tǒng)是他們的主打產(chǎn)品。

細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染情況總結(jié)如下:

常見的污染如下：

1、細(xì)菌：細(xì)菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀，根據(jù)感染細(xì)菌的不同，可有不同的外形，培養(yǎng)液一般會(huì)渾濁變黃，對細(xì)胞生長影響明顯。

仔細(xì)檢查一下器皿的滅菌情況，是否在高壓滅菌時(shí)放氣時(shí)間足夠，壓力足夠！尤其是和儲(chǔ)存培養(yǎng)液接觸的移液管等物品，連續(xù)兩次污染的話有可能造成儲(chǔ)存液污染，一定要注意！下次使用前檢查一下培養(yǎng)液是否存在渾濁的現(xiàn)象！

可在培養(yǎng)液中加相應(yīng)的抗生素處理

2、霉菌：培養(yǎng)液是清亮的，倒置顯微鏡下無雜質(zhì)，37度孵箱培養(yǎng)2-3天，仍清亮，但出現(xiàn)絮狀雜質(zhì)，鏡下可見呈細(xì)絲狀的團(tuán)狀漂浮物，可看到明顯的菌絲，細(xì)胞仍可生長，但時(shí)間長之后，細(xì)胞的活力狀態(tài)變差，用硫酸銅溶液擦拭CO2孵箱內(nèi)，再把水盤里也加上飽和量的硫酸銅。或者在培養(yǎng)箱的托盤加入飽和的消毒磷酸氫二鈉高鹽液體,可以防止霉菌污染。

CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有細(xì)胞暫時(shí)轉(zhuǎn)移，采用過氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把過氧乙酸放置在孵箱內(nèi)一個(gè)小時(shí)，使其蒸汽彌漫。待過氧乙酸的氣味消散后，再移入細(xì)胞。孵箱應(yīng)定期清潔（2月左右），尤其在多雨的季節(jié)。

其它培養(yǎng)箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外燈照。

預(yù)防霉菌污染，可在培養(yǎng)基里加3u/ml的兩性霉素或制霉菌素或放線菌素D或雙抗；但細(xì)胞一旦污染，很難挽救，制霉菌素或放線菌素D或雙抗都于事無補(bǔ)，建議舍棄該污染細(xì)胞。，將環(huán)境徹底消毒，如果所有細(xì)胞都污染，可能是系統(tǒng)污染，檢查一下培養(yǎng)基和器材，如果只是個(gè)別污染，可能是操作問題，就要注意操作

3、支原體：黑色的，好象多為多形，培養(yǎng)液一般培養(yǎng)液一般會(huì)渾濁，原體感染，國內(nèi)血清很多都沒有做支原體陰性檢測，而支原體是牛血清中最常見的微生物之一。而且它不能用過濾的辦法除去。支原體感染細(xì)胞以后，細(xì)胞病變不很明顯，只是慢慢死去。

用泰樂菌素，獸用支原體病的藥，但可用于細(xì)胞培養(yǎng)，無任何不良反應(yīng)。Sigma公司的使用時(shí)用50ug/mlTylosin培養(yǎng)液培養(yǎng)6天或連續(xù)傳兩代即可清除支原體污染。如果作為常用的抗生素的話,建議用8ug/ml的濃度。

4、黑蛟蟲：可以穿透濾膜，也可以通過空氣傳播，低倍下為黑色點(diǎn)狀，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去，培養(yǎng)液也是不渾的，一般不會(huì)太影響，細(xì)胞還是可以用的。常常是細(xì)胞生長狀態(tài)良好，且觀測到的運(yùn)動(dòng)物無明顯增多，且培養(yǎng)液顏色、透明度無明顯變化，可在同一批號的血清養(yǎng)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。對細(xì)胞生長狀態(tài)不會(huì)有明顯影響，在細(xì)胞增殖旺盛之后會(huì)自然消失，除更換血清外無須特殊處理。建議如果細(xì)胞有可能是此種污染的話，可以增加細(xì)胞的種板密度，以提高細(xì)胞的生存率。

5、真菌：一般培養(yǎng)液清亮，不變色，鏡下有絲狀物，有些真菌開始很像死細(xì)胞碎片，只是它很多很多的小塊很清楚，象珊瑚狀，不象細(xì)胞碎片分不清，慢慢的會(huì)長出很細(xì)的黑色絲狀物。真菌生長的比較慢，不象細(xì)菌那么容易被發(fā)現(xiàn)，但是一旦發(fā)現(xiàn)有它的存在細(xì)胞就被污染了，也很難救活了。

6、原蟲：培養(yǎng)液可輕微渾濁，顯微鏡下那些細(xì)小的點(diǎn)狀物數(shù)量非常多，輕微活動(dòng)，細(xì)胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢，而且細(xì)胞狀態(tài)不好，邊緣不清楚，細(xì)胞不透亮。他們與細(xì)胞可共生但會(huì)與細(xì)胞爭奪營養(yǎng)。這種共生是非常普遍的，但他們的數(shù)量小，細(xì)胞站優(yōu)勢所以不會(huì)影響到細(xì)胞的正常生長，只有當(dāng)他們到達(dá)一定的數(shù)量時(shí)就會(huì)影響到細(xì)胞的生長，最終形成惡性循環(huán)。

污染的可能原因：可能原因很多比如配液消毒問題、操作問題、環(huán)境問題等等

關(guān)于培養(yǎng)基的無菌狀況，取培養(yǎng)基至培養(yǎng)瓶中（不加細(xì)胞），37度試培養(yǎng)一段時(shí)間后觀察。如果沒有細(xì)菌生長就是操作的問題。

也可以在培養(yǎng)基中事先加入雙抗（硫酸鏈霉素和氨芐青霉素）。但雙抗有時(shí)會(huì)影響細(xì)胞的狀態(tài)，所以在做轉(zhuǎn)染、檢測細(xì)胞某項(xiàng)指標(biāo)前一定要撤去雙抗，以避免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1、孵箱應(yīng)定期用三氧機(jī)消毒 或者紫外光照射，并用酒精和新潔爾滅試擦孵箱同時(shí)孵箱內(nèi)的水應(yīng)是三蒸水

2、超凈臺(tái)取材器材培養(yǎng)液培養(yǎng)瓶操作等因素

3、超凈臺(tái)的風(fēng)機(jī)不能過大，風(fēng)機(jī)到6-8格。否則也可能能致霉菌污染

4、無菌室經(jīng)甲醛熏蒸消毒后，可用同等量的氨水噴灑中和，約幾小時(shí)即可進(jìn)入操作。

細(xì)胞培養(yǎng)常見問題及其解決

1、如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基？

培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在MEM中培養(yǎng)的細(xì)胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長?？傊?，首選MEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)好的開始。

2、何時(shí)須更換培養(yǎng)基？

視細(xì)胞生長密度而定，或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時(shí)間，按時(shí)更換培養(yǎng)基即可。

3、可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基？

不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基， 若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基， 細(xì)胞大都無法立即適應(yīng)，造成細(xì)胞無法存活。

4、可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類？

不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質(zhì)對于細(xì)胞的生長會(huì)產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無法存活。

5、何謂FBS, FCS, CS,HS ?

FBS (fetal bovineserum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯(cuò)誤的使用字眼，請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum)則是指馬血清。

6、培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用5 %或10% CO2？或根本沒有影響？

一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng)， 而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的CO2 濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用10 %CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時(shí)， 則應(yīng)使用5 % CO2 培養(yǎng)細(xì)胞。

7、Hank's平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用，不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么？Hank's平衡鹽溶液(HBS)和Earle's平衡鹽溶液(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別？

HBS和 EBS的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L)中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2中，溶液會(huì)變堿，Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會(huì)變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagles液，。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲(chǔ)存的組織，用Hanks液就可以了。

8、細(xì)胞之接種密度為何？

依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無法生長之一重要原因。

9、懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理？

一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中， 稀釋細(xì)胞濃度即可， 若培養(yǎng)液太多時(shí)， 可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高，直到無法容納為止。分瓶時(shí)取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶， 加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度，重復(fù)前述步驟即可。

10、冷凍管應(yīng)如何解凍？

取出冷凍管后， 須立即放入37°C 水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化， 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)， 必須注意安全， 預(yù)防冷凍管之爆裂。

11、細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)，是否應(yīng)馬上去除DMSO？

除少數(shù)特別注明對DMSO敏感之細(xì)胞外， 絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞）， 在解凍之后， 應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無法生長或貼附之問題。

12、附著性細(xì)胞繼代時(shí)所使用之trypsin-EDTA 濃度？應(yīng)如何處理？

一般使用之trypsin-EDTA濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中， 保存于–20°C，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin 之活性降低， 并可減少污染之機(jī)會(huì)。

13、欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？

欲回收動(dòng)物細(xì)胞，其離心速率一般為300xg (約1,000rpm)，5 - 10 分鐘， 過高之轉(zhuǎn)速，將造成細(xì)胞死亡。

14、細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？

動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95% 原來細(xì)胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能， 故不可將DMSO 直接加入細(xì)胞液中，必須使用前先行配制完成。

15、DMSO之等級和無菌過濾之方式為何？

冷凍保存使用之DMSO 等級，必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本身即為無菌狀況，第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中， 保存于4°C， 避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì)，并可減少污染之機(jī)會(huì)。若要過濾DMSO， 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質(zhì)濾膜。

16、冷凍保存細(xì)胞之方法？

冷凍保存方法一: 冷凍管置于4°C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80 °C 16~18 小時(shí)(或隔夜) → 液氮槽vaporphase長期儲(chǔ)存。

冷凍保存方法二:冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 °C 至–80 °C 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲(chǔ)存。*-20°C 不可超過1 小時(shí)， 以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

17、細(xì)胞欲冷凍保存時(shí)，細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？

冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x106cells/ml vial， 融合瘤細(xì)胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。

18、培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？

除于特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下， 培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。

19、應(yīng)如何避免細(xì)胞污染？

細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因?yàn)闊o菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等。嚴(yán)格之無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之最好方法。

20、如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時(shí)，應(yīng)如何處理？

原則上：直接滅菌后丟棄之。

當(dāng)重要的培養(yǎng)污染時(shí)，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細(xì)菌、真菌、支原體或酵母，把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開，用實(shí)驗(yàn)室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺(tái)，檢查HEPA過濾器。

高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細(xì)胞系有毒性，因而，做劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時(shí)尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實(shí)驗(yàn)步驟。

（1）在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計(jì)數(shù)和稀釋細(xì)胞，稀釋到常規(guī)細(xì)胞傳代的濃度。

（2）分散細(xì)胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個(gè)小培養(yǎng)瓶中。在一個(gè)濃度梯度范圍內(nèi)，把選擇抗生素加入到每一個(gè)孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0mg/ml。

（3）每天觀測細(xì)胞毒性指標(biāo)，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。

（4）確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2～3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞2～3代。

（5）在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一代。

（6）重復(fù)步驟4。

（7）在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～6代，確定污染是否以已被消除。

21、支原體(mycoplasma) 污染的細(xì)胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？

不能。除極有經(jīng)驗(yàn)之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株， 無法以其外觀分辨之。

22、支原體污染會(huì)對細(xì)胞培養(yǎng)有何影響？

支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長參數(shù)，代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasma-free，實(shí)驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。

23、偵測出細(xì)胞株有支原體污染時(shí)，該如何處理？

直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細(xì)胞株。

24、CO2培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔？

定期(至少每兩周一次)以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。

25、為何培養(yǎng)基保存于4 °C冰箱中， 顏色會(huì)偏暗紅色， 且pH值會(huì)越來越偏堿性？

培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中，培養(yǎng)基內(nèi)之CO2 會(huì)逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenol red)的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果， 將造成細(xì)胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí)， 可以通入無菌過濾之CO2， 以調(diào)整pH值。

26、各種細(xì)胞培養(yǎng)用的dish，flask是否均相同？

不同廠牌的dish 或flask，其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 雖對大部分細(xì)胞沒有太大之影響，惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異。

27、購買之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后，為何會(huì)發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形？

研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少， 大都是因?yàn)殡x心過程操作上的失誤， 造成細(xì)胞的物理性損傷，以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心， 應(yīng)待細(xì)胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。

28、購買之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因？

研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯(cuò)誤。冷凍細(xì)胞解凍后，加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤。細(xì)胞置于–80 °C 太久。

29、L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？

L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時(shí)間后會(huì)降解，但是確切的降解率一直沒有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對于一些細(xì)胞具有毒性。

30、GlutaMAX-I是什么？培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I？這個(gè)二肽有多穩(wěn)定？

GlutaMAX-I二肽是一個(gè)L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。

GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎完全降解。

31、什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？

酚紅在培養(yǎng)基中用作PH值的指示劑：中性時(shí)為紅色，酸性時(shí)為黃色，堿性時(shí)為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí)，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測時(shí)，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。

32、如何用臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞？

用無血清培養(yǎng)基把細(xì)胞懸液稀釋到200～2000個(gè)/毫升，在0.1毫升細(xì)胞懸液中加0.1毫升0.4％的臺(tái)盼蘭溶液。輕輕混勻，數(shù)分鐘后，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞?；罴?xì)胞排斥臺(tái)盼蘭，因而染成藍(lán)色細(xì)胞是死細(xì)胞。

33、培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？

丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。

34、二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時(shí)加入EDTA的目的是什么？

二價(jià)離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用EDTA清洗細(xì)胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子。

35、室溫下配制的Tris-HCl溶液，在37℃使用時(shí)PH值是多少？

緩沖液PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC溶液在4℃，25℃，37℃時(shí)，不同PH值。

50mM Tris-HC溶液在4℃，25℃，37℃時(shí)，不同PH值

4°C25°C 37°C

8.18.57.2

8.27.67.3

8.37.77.4

8.47.87.5

8.57.97.6

8.68.07.7

8.78.17.8

8.88.27.9

8.98.38.0

9.08.48.1

9.18.58.2

9.28.68.3

9.38.78.4

9.48.8 8.5

36、如何從T25瓶中轉(zhuǎn)移sf9細(xì)胞？能用胰蛋白酶消化嗎？

我們推薦使用脫落細(xì)胞的方法，此技術(shù)破壞性最小，生活力最高。通過使用巴斯德吸液管，讓細(xì)胞上培養(yǎng)基流動(dòng)。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養(yǎng)瓶。只有在絕對必要的情況下，才使用胰酶消化細(xì)胞。

37、胰酶消化一個(gè)T25瓶的sf9細(xì)胞：

（1）去除培養(yǎng)基。

（2）用2ml1xPBS（足以覆蓋細(xì)胞表面）洗滌細(xì)胞，去除PBS。

（3）加入2ml1x胰酶EDTA（恰好覆蓋細(xì)胞表面）。

（4）37℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測看到5分鐘后它們正在向上移動(dòng)。

（5）向細(xì)胞中加入2ml細(xì)胞培養(yǎng)液，移入錐形管，用2ml培養(yǎng)液洗瓶壁，移入同一錐形管中。（培養(yǎng)基中的FBS終止了胰酶的活性。）

（6）離心（1100rpm）沉淀細(xì)胞。去除培養(yǎng)基。

（7）用新的培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞。傳代。

38、在Sf9, Sf21,和high Five細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)，肝素的使用量是多少？

為了防止懸浮培養(yǎng)細(xì)胞聚集的形成，使用肝素濃度為10單位/毫升細(xì)胞懸液。

39、在重新凍存sf9細(xì)胞前，它可以傳多少代？隨著傳代的次數(shù)的增加，它的感染能力會(huì)降低嗎？

通常情況當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過30次傳代后，應(yīng)該返回凍存。無論什么時(shí)候計(jì)數(shù)時(shí)，都應(yīng)該檢查細(xì)胞活力。如果超過95％的細(xì)胞保持有活力和在大約30小時(shí)左右加倍，細(xì)胞仍然可以使用。如果活力和加倍時(shí)間下降，它們的感染力將不在是有效的。

40、貯存在冰箱中的瓶口已開的培養(yǎng)基，在放置幾天后顏色變紫?

這主要是由于在暴露到周圍的CO2水平時(shí)，碳酸氫納導(dǎo)致了pH值的上升。您可以在使用前松開瓶口，在CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)基10-15分鐘，來校正溶液的pH值（確定松開瓶口以保證氣體交換）。

41、細(xì)胞培養(yǎng)基偶然被凍，可否繼續(xù)使用？

如果細(xì)胞培養(yǎng)基偶然被凍，您應(yīng)該熔化培養(yǎng)基并觀察是否有沉淀產(chǎn)生。如果沒有沉淀產(chǎn)生，培養(yǎng)基可以正常使用，如果出現(xiàn)沉淀，只能丟棄這些培養(yǎng)基。

42、無血清培養(yǎng)與有血清培養(yǎng)使用的抗生素量一樣嗎？

當(dāng)在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時(shí)，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。血清蛋白會(huì)結(jié)合和滅活一些抗生素。在無血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活，可能對于細(xì)胞達(dá)到毒性水平。

43、培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后，可長期保存嗎？

一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí)，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_始降解。

44、培養(yǎng)基及其它添加物和試劑可反復(fù)凍融嗎？

大部分添加物和試劑最多可以凍融3次，如果次數(shù)更多都會(huì)在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會(huì)影響它的性能。

45、為什么要在溶解的一周內(nèi)使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液?

胰蛋白酶在4℃就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘，就會(huì)變得不穩(wěn)定。

46、保存血清最好的方法?

我們建議血清應(yīng)保存在-5℃至-2O℃。若存放于4℃時(shí)，請勿超過一個(gè)月。若一次無法用完一瓶，建議無菌分裝血清至恰當(dāng)?shù)臏缇萜鲀?nèi)，再放回冷凍。

47、如何解凍血清才不會(huì)使產(chǎn)品質(zhì)量受損?

將血清從冷凍箱取出后，先置于2～8℃冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融。但必須注意的是，融解過程中必須規(guī)則地?fù)u晃均勻。

48、血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn)，該如何處理?

血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后，也會(huì)存在于血清中，亦是造成沉淀物的原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質(zhì)量。

若欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無菌離心管內(nèi)，以400g稍微離心,上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾。最好不使用過濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因?yàn)樗赡軙?huì)阻塞過濾膜。

49、為什么要熱滅活血清?

加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。激活的補(bǔ)體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在免疫學(xué)研究，培養(yǎng)ES細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞時(shí)，推薦使用熱滅活血清。

50、有必要做熱滅活嗎?

實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)過正確處理的熱滅活血清，對大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對細(xì)胞的生長只有微小的促進(jìn)，或完全沒有任何作用，甚至通常因?yàn)楦邷靥幚碛绊懥搜宓馁|(zhì)量，而造成細(xì)胞生長速率的降低。而經(jīng)過熱處理的血清，沉淀物的形成會(huì)顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點(diǎn)”，常常會(huì)讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37℃環(huán)境中，又會(huì)使此沉淀物更增多，使研究者誤認(rèn)為是微生物的分裂擴(kuò)增。

若非必須，可以不需要做熱處理這一步。不但節(jié)省時(shí)間，更確保血清的質(zhì)量!

51、為什么儲(chǔ)存在冰箱中的胎牛血清會(huì)出現(xiàn)沉淀?

有些胎牛血清產(chǎn)品沒有預(yù)老化，儲(chǔ)存在2－8℃時(shí)，血清中的各種蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應(yīng)該不會(huì)影響血清的質(zhì)量。推薦在－20℃儲(chǔ)存胎牛血清，避免反復(fù)凍融。

52、如何避免沉淀物的產(chǎn)生?

我們建議您在使用血清的時(shí)候，注意下列的操作:

(1)解凍血清時(shí)，請按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫)，若血清解凍時(shí)改變的溫度太大(如-20℃至37℃)，非常容易產(chǎn)生沉淀物。

(2)解凍血清時(shí)，請隨時(shí)將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。

(3)請勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清會(huì)變得混濁，同時(shí)血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會(huì)因此受到損害，而影響血清的質(zhì)量。

(4)血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。

(5)若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃，30分鐘的原則，并且隨時(shí)搖晃均勻。溫度過高，時(shí)間過久或搖晃不均勻，都會(huì)造成沉淀物的增多。

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