愛華網(wǎng)摘要:本文簡要介紹了蘇云金芽孢桿菌的分類及活性成分，總結(jié)概括了蘇云金芽孢桿菌最新的一些相關(guān)研究進(jìn)展，并分析了其中存在的問題并對(duì)其應(yīng)用前景進(jìn)行了展望
關(guān)鍵詞：蘇云金芽孢桿菌；研究進(jìn)展；生物農(nóng)藥；綜述
Abstract
This article gives a brief introduction of the classification ofthe Bacillus thuringiensis (Bt) and its active constituents, andsummarizes some new researches related to Bt. The problems in itsapplication and its prospect are also analyzed in it.
Key words: Bacillus thuringiensis, Bt, Biopesticide
隨著人們的環(huán)保意識(shí)不斷增強(qiáng)，生物農(nóng)藥正在引起越來越多的關(guān)注。近年來，生防研究進(jìn)展速度明顯加快，世界各國對(duì)此項(xiàng)研究也十分關(guān)注。從總體看，目前我國的微生物農(nóng)藥研究開發(fā)已經(jīng)具有一定的生產(chǎn)規(guī)模。從品種分類來看，各類品種的研究開發(fā)所達(dá)到的層次和規(guī)模差異較大。隨著微生物農(nóng)藥研究的深入和應(yīng)用技術(shù)的發(fā)展，微生物農(nóng)藥的種類和數(shù)量越來越多，市場份額將會(huì)不斷擴(kuò)大，在有害生物防治中的作用也會(huì)越來越大。而在微生物農(nóng)藥中，蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis，Bt）是世界公認(rèn)的生產(chǎn)規(guī)模最大、應(yīng)用最廣泛、最有前途的微生物農(nóng)藥，它在微生物防治害蟲的實(shí)踐中，占有極其重要的地位。它是世界目前運(yùn)用最為成功的微生物殺蟲劑。隨著分子生物學(xué)理論及其技術(shù)的成熟和發(fā)展，蘇云金芽孢桿菌的相關(guān)研究更加廣泛而深入，蘇云金芽孢桿菌的獨(dú)特作用也得到了進(jìn)一步的發(fā)揮。
1 簡介
在全世界范圍內(nèi)，蟲害一直是制約農(nóng)作物高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的重要因素。長期以來以化學(xué)農(nóng)藥作為防治害蟲的主要手段，化學(xué)農(nóng)藥大量和不合理使用，其弊端日益突出，不僅對(duì)人畜有嚴(yán)重的危害，也會(huì)引起自然界中的殘留及在食物鏈中的富積造成嚴(yán)重的環(huán)境污染?；瘜W(xué)農(nóng)藥作用方式往往是非特異性的，在殺蟲害的同時(shí)，也殺死了有益的昆蟲及害蟲的天敵，造成生態(tài)平衡的破壞，引起害蟲的再度猖獗，已成為害蟲防治上急需解決的問題。而微生物農(nóng)藥卻能克服上述缺點(diǎn)，蘇云金桿菌制劑的研究與應(yīng)用成為生物農(nóng)藥熱點(diǎn)，也是世界上研究最為深入應(yīng)用最為廣泛的微生物殺蟲劑[1-3]。
1.1蘇云金芽孢桿菌的研究歷史
蘇云金芽孢桿菌于1901年在日本被發(fā)現(xiàn)，1911年由柏林納從地中海粉螟的患病幼蟲中分離出來，并依其發(fā)現(xiàn)地點(diǎn)德國蘇云金省而命名。蘇云金芽孢桿菌簡稱蘇云金桿菌，是內(nèi)生芽孢的革蘭氏陽性土壤細(xì)菌，在芽孢形成初期會(huì)形成殺蟲晶體蛋白(insecticidalcrystalprotein)，對(duì)敏感昆蟲有特異性的防治作用。1956年前蘇聯(lián)發(fā)表了用液體培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)蘇云金桿菌并用于防治菜青蟲的報(bào)道，從而揭開了蘇云金桿菌大規(guī)模培養(yǎng)的序幕。中國從上世紀(jì)60年代也開始了規(guī)模化生產(chǎn)。
1.2 蘇云金芽孢桿菌的分類
蘇云金芽孢桿菌是一種自然界廣泛分布的好氣芽孢桿菌，革蘭氏染色陽性，在《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第九版中被列為第二類第十八群的芽孢桿菌屬中的一個(gè)種，主要特性在于形成芽孢的同時(shí)在菌體內(nèi)形成具有蛋白質(zhì)性質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)伴孢晶體，這是蘇云金芽孢桿菌區(qū)別于其近緣種一蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus，Bc)最重要的特征。隨著蘇云金芽孢桿菌類似的新品系和新菌種逐漸被分離發(fā)現(xiàn)，各種種內(nèi)分類方法被相繼提出，并將該菌區(qū)分為不同的亞種、變種、血清型、生物型、致病型及晶體型。這些方法包括生化試驗(yàn)法、晶體抗原法、酯酶法、噬菌體法等，但迄今被普遍接受和采用的是由deBarjac和Bonnefoi提出的根據(jù)鞭毛抗原(H-抗原)的特異性而劃分為不同的血清型，再區(qū)分為不同亞種的方法。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，人們嘗試將多種分子生物學(xué)手段用于蘇云金芽孢桿菌的分類，如16srDNA、多位點(diǎn)酶電泳、隨機(jī)引物PCR的DNA指紋圖譜、限制性片段長度多態(tài)性等。
1.3 蘇云金芽孢桿菌的活性成分
蘇云金芽孢桿菌能產(chǎn)生多種的毒素，其活性成分研究也由剛開始的殺蟲晶體蛋白發(fā)展到多種成分，其中非殺蟲活性成分功能的發(fā)現(xiàn)，更為蘇云金芽孢桿菌的實(shí)際應(yīng)用，開辟了新的廣闊前景。
1.3.1伴孢晶體
伴孢晶體又稱殺蟲晶體蛋白(insecticidal crystal proteins，ICPs)，是蘇云金芽孢桿菌殺蟲的主要成分。ICPs又稱δ-內(nèi)毒素(δ-endotoxin)，由于該基因產(chǎn)物絕大部分形成晶體(crystal)，所以又稱cry基因，而且基因類型同殺蟲活性關(guān)系密切，通過鑒定菌株的ICPs基因類型可以預(yù)測其殺蟲活性，同時(shí)對(duì)于發(fā)現(xiàn)新基因、新殺蟲譜具有重要意義，因此ICPs基因類型的分類和鑒定越來越受到重視。
1.3.2營養(yǎng)期殺蟲蛋白
營養(yǎng)期殺蟲蛋白(vegetative insecticalproteins，Vips)是蘇云金芽孢桿菌在營養(yǎng)期產(chǎn)生的一種非晶體的殺蟲蛋白。Vips主要分為Vip1、Vip2、Vip3等3種。Vip1和Vip2構(gòu)成二元毒素，對(duì)鞘翅目葉甲科的昆蟲具有殺蟲特異性；而Vip3對(duì)鱗翅目昆蟲具有廣譜的殺蟲活性。Vips是以與ICPs相類似的方式產(chǎn)生致病作用，即主要是通過與敏感昆蟲中腸上皮細(xì)胞受體結(jié)合，使中腸潰爛而使昆蟲死亡，但二者作用機(jī)理不同：ICPs是與受體結(jié)合，導(dǎo)致昆蟲膜穿孔引起昆蟲死亡；Vips是與受體結(jié)合誘發(fā)細(xì)胞凋亡，這為篩選新的殺蟲活性物質(zhì)提供了新的思路。Vips對(duì)一些ICPs不敏感的昆蟲(如甜菜夜蛾、小地老虎、草地貪夜蛾、煙蚜夜蛾等)具有極強(qiáng)的殺蟲活性。
1.3.3雙效菌素雙效菌素
雙效菌素雙效菌素(zwittermicinA，ZwA)是在蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一種氨基多元醇類化合物，在中性和酸性條件較穩(wěn)定，堿性條件下易水解。ZwA單獨(dú)存在時(shí)殺蟲活性很低，與蘇云金芽孢桿菌其他活性物質(zhì)混合使用具有很高的增效作用，對(duì)夜娥科昆蟲效果尤為顯著。Broderick等(2000)研究證實(shí)，純ZwA對(duì)Gypsymoth幾乎沒有致死作用，而加有0.65IU的蘇云金芽孢桿菌庫斯塔克亞種菌劑時(shí)LD95為9.4ng，加至10ng時(shí)致死率已達(dá)100％。ZwA不僅能增強(qiáng)蘇云金芽孢桿菌的殺蟲效果，而且還能延緩害蟲的抗性發(fā)生。此外，它還具有抑制疫酶和腐酶的生長作用。
1.3.4幾丁質(zhì)酶
幾丁質(zhì)酶(Chitinase)是蘇云金芽孢桿菌分泌的胞外蛋白質(zhì)類殺蟲活性物質(zhì)。林毅等利用設(shè)計(jì)的一對(duì)幾丁質(zhì)酶基因引物，以l5株不同血清型的蘇云金芽孢桿菌DNA為模板，擴(kuò)增幾丁質(zhì)酶全長基因，發(fā)現(xiàn)有9個(gè)菌株存在該基因，陽性率達(dá)60％，這與多數(shù)學(xué)者對(duì)幾丁質(zhì)酶的檢測結(jié)果基本一致。由此證明超過50％的蘇云金芽孢桿菌菌株能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。幾丁質(zhì)酶在生物防治方面有2大用途：其一可以防治真菌病害。因?yàn)槌丫馑姓婢募?xì)胞壁都含有幾丁質(zhì)，通過水解細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)可有效的抑制真菌的生長。其二可以增強(qiáng)蘇云金芽孢桿菌殺蟲效果，主要因昆蟲中腸圍食膜的主要成分幾丁質(zhì)，是昆蟲防治病原菌和病毒的屏障，被幾丁質(zhì)酶破壞后，殺蟲蛋白可進(jìn)一步作用形成中腸穿孔。
1.3.5蘇云金素
蘇云金素(thuringiensin)又稱β-外毒素，是在蘇云金芽孢桿菌生長過程中被分泌到細(xì)胞外，且對(duì)蠅類毒力很高，又被稱蠅因子。它的殺蟲活性比ICPs還廣，對(duì)人及哺乳動(dòng)物都有一定的毒性，其毒性大小取決于體內(nèi)吸收比例和體內(nèi)酶將其脫磷成無毒產(chǎn)物的程度。由于去磷酸的蘇云金素?zé)o毒，通過結(jié)構(gòu)修飾制備對(duì)昆蟲毒力更高。對(duì)人畜安全的蘇云金素衍生物已引起了科研人員的重視。
1.3.6腸毒素
腸毒素(enterotoxin)是根據(jù)Bc能產(chǎn)生腸毒素而發(fā)現(xiàn)的，因?yàn)榕cBc有緊密關(guān)系，因此蘇云金芽孢桿菌腸毒素與Bc腸毒素也有高度的相似性。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)有無溶血腸毒素(non—haemolyticenterotoxin，NHE)、溶血腸毒素(haemolyticenterotoxin，HBL)和臘狀芽孢桿菌毒素(Bacilluscereus—toxin，bceT)3種腸毒素，除腸毒素HBL外，其余均無溶血活性。Gaviria et.al(2000)對(duì)24種血清型74株菌株的檢測，發(fā)現(xiàn)NHE的分布頻率高達(dá)100％。
1.3.7自身誘導(dǎo)物抑制蛋白
自身誘導(dǎo)物抑制蛋白(autoinducerinhibitor，Aii)是一種非分泌型的胞內(nèi)蛋白，相應(yīng)基因位于染色體，與Vips一樣是在蘇云金芽孢桿菌培養(yǎng)初期就開始表達(dá)，并一直延續(xù)到芽孢形成前期。該蛋白可以水解N-?；呓z氨酸內(nèi)酯(N-acylhomoserinelactone，AHL)，使其失去活性；而AHL是許多革蘭氏陰性植物病原菌細(xì)胞間傳遞信息的信號(hào)分子，當(dāng)其在細(xì)胞濃度達(dá)到一定水平時(shí)，就能激活細(xì)胞中某些基因的表達(dá)，促使植物病原菌細(xì)胞產(chǎn)生致病作用。
1.3.8芽孢
芽孢(spore)是蘇云金芽孢桿菌生長到一定階段形成的一種結(jié)構(gòu)，是營養(yǎng)細(xì)胞的休眠體。蘇云金芽孢桿菌芽孢可以單獨(dú)或通過晶體對(duì)昆蟲起毒性作用，其致病作用至少有2個(gè)因素：一是芽孢衣蛋白質(zhì)具有類似ICPs毒素的作用，二是芽孢萌發(fā)成營養(yǎng)細(xì)胞具有穿透昆蟲腸壁的能力。
2蘇云金芽孢桿菌在動(dòng)物疾病防治上的應(yīng)用[4-6]
2.1用蘇云金芽孢桿菌防治動(dòng)物捻轉(zhuǎn)血矛線蟲
國內(nèi)有多位學(xué)者探索蘇云金芽孢桿菌防治不同時(shí)期捻轉(zhuǎn)血矛線蟲，均已取得較好效果。姚寶安等(1995)發(fā)現(xiàn)至少有12株蘇云金芽孢桿菌對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲第1、2期幼蟲有殺滅作用，這些蘇云金芽孢桿菌包括以色列亞種和庫斯塔克亞種在內(nèi)的9個(gè)亞種，其中1株蘇云金芽孢桿菌至今還沒有發(fā)現(xiàn)它對(duì)任何昆蟲有毒，但卻對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲具有很高的毒性。周林等(1999)發(fā)現(xiàn)至少有10株蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體毒素對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲第3期幼蟲有殺滅作用，而且幼蟲死亡率可達(dá)100％，不同菌株對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的毒力差異極顯著，此外，作用時(shí)間適當(dāng)延長，作用劑量稍有增大，幼蟲的死亡率也相應(yīng)增加。王祥等(1999)也篩選到2株對(duì)捻轉(zhuǎn)血矛線蟲第4期有效的蘇云金芽孢桿菌菌株，但第四期幼蟲是在動(dòng)物皺胃內(nèi)，有關(guān)蘇云金芽孢桿菌臨床應(yīng)用的劑型和給藥途徑，還有待進(jìn)一步研究。
2.2用蘇云金芽孢桿菌研制熱穩(wěn)定性禽流感口服疫苗
劉梅等(2007)利用蘇云金芽孢桿菌具有很強(qiáng)熱穩(wěn)定性及對(duì)畜禽無毒性的優(yōu)點(diǎn)，通過建立蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞表面展示系統(tǒng)，即將AJ基因與S一層蛋白(Surface layerprotein)融合后，AI病毒NP蛋白展示到受體菌株表面，從而開發(fā)出活菌疫苗。該熱穩(wěn)定性AIV—蘇云金芽孢桿菌重組口服疫苗在對(duì)小鼠的實(shí)驗(yàn)中，表現(xiàn)較強(qiáng)免疫原性。
2.3用蘇云金芽孢桿菌防治動(dòng)物血吸蟲病
周艷琴等(2005)已篩選出了對(duì)日本血吸蟲童蟲、成蟲有殺滅作用的蘇云金芽孢桿菌菌株，而目前治療血吸蟲病的主要藥物吡喹酮對(duì)3d、7d、14d日本血吸蟲童蟲沒有治療效果，蘇云金芽孢桿菌在防治日本血吸蟲童蟲方面顯示出了巨大優(yōu)勢(shì)。周艷琴等(2007)通過蘇云金芽孢桿菌引發(fā)的血吸蟲超微結(jié)構(gòu)改變，來闡述其對(duì)血吸蟲的作用機(jī)理蘇云金芽孢桿菌。研究發(fā)現(xiàn)蘇云金芽孢桿菌引發(fā)血吸蟲表皮的各種變化，包括基質(zhì)空泡化，褶嵴腫脹粘連，基膜和環(huán)肌腫脹，桿狀分泌小體和指環(huán)體減少，感覺結(jié)構(gòu)壞死，環(huán)肌溶解；而蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體毒素引起鱗翅目昆蟲腸上皮細(xì)胞的變化主要是細(xì)胞肥大，微絨毛膨脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核、線粒體相繼出現(xiàn)病變，這提示蘇云金芽孢桿菌對(duì)血吸蟲的作用機(jī)理，顯然不同于其對(duì)昆蟲幼蟲的機(jī)理。
2.4用蘇云金芽孢桿菌防治豬蛔蟲病
鄧干臻等(2004)從25株對(duì)豬蛔蟲有效菌株中篩選到毒力最強(qiáng)菌株，發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)豬蛔蟲第4期幼蟲作用快速而持久。馮漢利等(2007)選用對(duì)豬蛔蟲有高毒性的蘇云金芽孢桿菌菌株，分別采用灌胃、靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射4種不同的方式給小鼠注入蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白，通過計(jì)算減蟲率來確定最佳的蘇云金芽孢桿菌作用方式，并以免疫組織化學(xué)法，利用對(duì)豬蛔蟲幼蟲敏感的Icps抗體來檢測其在蟲體上的結(jié)合部位，結(jié)果表明，靜脈注射、肌肉注射、灌胃、腹腔注射對(duì)小鼠體內(nèi)蛔蟲均有顯著效果，靜脈注射減蟲率最高，效果極顯著高于其他3種方式，而肌肉注射則次之，灌胃與腹腔注射無差異；免疫組化定位顯示Icps結(jié)合到蟲體的體表及腸道。
2.5用蘇云金芽孢桿菌防治綿羊綠銅蠅
饒麗娟等(2005)報(bào)道用蘇云金芽孢伴孢晶體蛋白Cyt1Aa和Cyt2Aa對(duì)3種綿羊綠銅蠅幼蟲進(jìn)行生物測定，發(fā)現(xiàn)Cyt1Aa晶體無毒，全長可溶蛋白具有一定毒力，Cyt1Aa蛋白經(jīng)胰蛋白酶處理后毒力最強(qiáng)。Cyt2Aa蛋白無論是晶體，全長可溶蛋白，還是經(jīng)胰蛋白酶處理均對(duì)3種綿羊綠銅蠅無毒力。這為蘇云金芽孢桿菌防治蠅類作了有益的探索。
2.6用蘇云金芽孢桿菌防治蚊蟲
從1976年起，人們就將目光轉(zhuǎn)向蘇云金芽孢桿菌對(duì)蚊蟲的研究和應(yīng)用上。Bti是研究時(shí)間較早、研究內(nèi)容較深、應(yīng)用范圍較廣的亞種，它作為生物殺蚊劑被廣泛用于蚊、蠅數(shù)量的控制。Bti是一種革蘭氏陽性能形成芽孢的好氧桿菌，它能產(chǎn)生一種晶體蛋白，當(dāng)被蚊子幼蟲攝食后變成毒蛋白。毒蛋白通過結(jié)合上皮細(xì)胞細(xì)胞壁上的特殊受體，導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔，最后致死。
2.7用蘇云金芽孢桿菌防治細(xì)菌引起的感染性疾病
日本學(xué)者Yudian TF等(1992)發(fā)現(xiàn)一些蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素對(duì)微球菌、葡萄球菌、諾卡氏菌屬、鏈霉菌的生長有一定的影響。目前，蘇云金芽孢桿菌ssp.emomocidus HD9、蘇云金芽孢桿菌 ssp.israelensis B2395、蘇云金芽孢桿菌BMG1.7和蘇云金芽孢桿菌 strainB439等4種殺菌株的殺菌、溶菌、抑菌作用得到了較深入的研究。這些菌株的抗菌作用是通過分泌到胞外的細(xì)菌素來實(shí)現(xiàn)，其抗菌活性在生長對(duì)數(shù)期中期開始，到生長靜止期初期達(dá)到最大。CherifiA等(2003)報(bào)道蘇云金芽孢桿菌 ssp.entomocidusHD9對(duì)革蘭陽性菌如單核細(xì)胞增多性李氏菌、致病性假單孢菌、銅綠菌和一些真菌類有殺死細(xì)菌和使生長期的細(xì)胞溶解的活性，其活性物質(zhì)為12.4kD的蛋白質(zhì)，pH3.9活性穩(wěn)定、經(jīng)蛋白酶K處理活性消失。CherifA等(2001)證實(shí)蘇云金芽孢桿菌BMG1.7所產(chǎn)生的毒素不僅對(duì)其他幾種蘇云金芽孢桿菌有拮抗作用而且對(duì)金黃色釀膿葡萄球菌和單核細(xì)胞增多性李氏菌屬有抑制作用，其活性蛋白相對(duì)分子量為11.6kD，具有耐熱的特性。ManasherobR等(2003)發(fā)現(xiàn)蘇云金芽孢桿菌以色列亞種產(chǎn)生的Cyt1Aa細(xì)胞毒素可誘使希氏桿菌屬大腸桿菌的類核物質(zhì)在細(xì)胞中央凝結(jié)，而且凝結(jié)效果比氯霉素所引起的類核物質(zhì)的凝結(jié)更明顯。
3 蘇云金芽孢桿菌在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用
3.1用蘇云金芽孢桿菌防治酒曲害蟲黑菌蟲
利用生物殺蟲劑蘇云金桿菌防治大曲害蟲，具有高效性、安全性、經(jīng)濟(jì)性、科學(xué)性等優(yōu)點(diǎn)。曾建德[7-8]等研究結(jié)果表明在30℃條件下，蘇云金芽孢桿菌液體制劑達(dá)到0.10mL／g的劑量時(shí)，可使黑菌蟲的校正死亡率達(dá)100％，且殺蟲后大曲的糖化力、發(fā)酵力、微生物的數(shù)量變化極小。
3.2用蘇云金芽孢桿菌防治棉鈴蟲
1990年，中國農(nóng)科院與江蘇省農(nóng)科院合作，成功地將蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白基因?qū)氪竺娣e推廣的棉花品種中，證明已獲得轉(zhuǎn)基因抗棉鈴蟲棉植株。許提森[9]通過初步比較LY3o和HD-1茵株的形態(tài)特征、生理生化特性，并采用生物測定的方法，比較它們對(duì)棉鈴蟲初孵、二齡、三齡幼蟲的毒效差異。發(fā)現(xiàn)LY30茵株對(duì)棉鈴蟲三齡以下的幼蟲具有高毒力。Kong-MingWu[10]等對(duì)中國北方六個(gè)省的抗蟲棉種植情況做了10年的跟蹤調(diào)查發(fā)現(xiàn)，抗蟲棉不僅能夠控制棉鈴蟲及其對(duì)其它作物的侵害，而且能夠總體上減少殺蟲劑的使用量。
3.3 用蘇云金芽孢桿菌防治水稻稻縱卷葉螟
稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocis medinalisGuen6e)是我國水稻上的主要害蟲，水稻受害后，一般減產(chǎn)1～2成，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)達(dá)3成以上。常規(guī)有機(jī)磷農(nóng)藥毒性高、對(duì)天敵殺傷大、副作用大。且生產(chǎn)上用于防治稻縱卷葉螟的主要藥劑甲胺磷已被禁用。
董蘭[11]選用阿維菌素 2％乳油和蘇云金桿菌 8000 IU／mg可濕性粉劑進(jìn)行防治稻縱卷葉螟田間試驗(yàn)。藥后13d調(diào)查結(jié)果表明，使用阿維菌素 2％乳油 20~30mL／667m 和蘇云金桿菌8000 IU／mg可濕性粉劑200g／667m 防效均在90％以上。阿維菌素 2％乳油3Om/667m的防效與生產(chǎn)上常用的有機(jī)磷類農(nóng)藥毒死蜱480g/mL油常用劑量的防效無顯著差異。是防治稻縱卷葉螟的理想替換農(nóng)藥，可和其他農(nóng)藥輪換使用，以延緩稻縱卷葉螟對(duì)單一農(nóng)藥的抗藥性。
3.4 用蘇云金芽孢桿菌防治楊樹食葉害蟲
近年來，隨著楊樹純林面積的擴(kuò)大，楊樹病蟲發(fā)生也呈上升趨勢(shì)。目前，楊樹食葉害蟲主要有楊扇舟蛾、楊小舟蛾、楊黃卷葉螟等。以往防治楊樹食葉害蟲通常使用一些常規(guī)的化學(xué)農(nóng)藥，為提高防治效果，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，推行生物防治，俞先儉[12]等選用蘇云金桿茵制劑—森得寶可濕性粉劑進(jìn)行防治楊樹食葉害蟲(楊扇舟蛾)試驗(yàn)，結(jié)果表明，森得寶對(duì)楊樹舟蛾防效好，且對(duì)楊樹嫩梢不產(chǎn)生藥害，建議大面積推廣應(yīng)用，用藥濃度以1000～3000倍液為宜。
3.5 用蘇云金芽孢桿菌防治根結(jié)線蟲
寄生的植物線蟲具有很重的危害，尤其是根結(jié)線蟲。由于人們對(duì)于環(huán)境安全的關(guān)注，合成的化學(xué)殺線蟲劑已經(jīng)被禁用，例如溴甲烷，這使得該種病害更加難以控制。因此開發(fā)安全有效的生物殺線蟲劑顯得尤為必要。LiuBin[13]等通過研究發(fā)現(xiàn)一株能夠很好的抑制植物根線蟲的蘇云金芽孢桿菌菌株。
3.6 用蘇云金芽孢桿菌防治蔬菜害蟲
韓嵐嵐[14]等通過利用已克隆的3種蘇云金芽孢桿菌cry基因crylCa、crylIa、cry2Ab和1種野生菌株HD-73(crylAc)表達(dá)的4種蘇云金芽孢桿菌Cry殺蟲晶體蛋白，對(duì)小菜蛾進(jìn)行生物活性分析，并將CrylAc殺蟲晶體蛋白分別與其它3種蛋白按1：1的比例組合，對(duì)小菜蛾進(jìn)行生物活性測定。結(jié)果表明單獨(dú)使用CrylAc的活性最高，LC50為2.39g／mL，CrylAc與Cry2Ab混合對(duì)小菜蛾的具有較高的毒力，LC50為48.91，高于其它組合。
3.7 用蘇云金芽孢桿菌防治春尺蠖
吳雪碧[15]等研究發(fā)現(xiàn)不同濃度蘇云金芽孢桿菌粉劑藥液防治春尺蠖不同齡期幼蟲試驗(yàn)結(jié)果表明：200倍液濃度10d后防效達(dá)到了100％，是防治春尺蠖幼蟲最理想的濃度。300倍液濃度防效更正減退率達(dá)到97％，根據(jù)各地地理?xiàng)l件、氣候條件、蟲口密度等。也可采用300倍液濃度進(jìn)行防治。
4 國內(nèi)外對(duì)于蘇云金芽孢桿菌的研究內(nèi)容
國內(nèi)外對(duì)于蘇云金芽孢桿菌的研究大致包括菌株篩選、殺蟲機(jī)制、基因工程、遺傳工程、發(fā)酵條件優(yōu)化、生物農(nóng)藥劑型等相關(guān)方面。
為了提高蘇云金芽孢桿菌的蛋白表達(dá)量和菌株的穩(wěn)定性，人們一直致力于篩選理想的菌株。宋健[16]等測定了19種化合物包括無機(jī)鹽、有機(jī)物等，在添加濃度為0.1％，0.2％，0.5％和0.8％的劑量下對(duì)HBF-1晶體粉劑的增效作用。結(jié)果表明：無機(jī)類：MgS04(0.5％，0.8％)、CaCl2(0.5％，0.8％)、MgC12(0.5％，0.8％)等三種物質(zhì)有顯著的增效作用；有機(jī)類：檸檬酸(0.2％，0.5％，0.8％)對(duì)HBF-1菌株有明顯增效作用。楊德俊[17]等通過向培養(yǎng)基中添加稀土離子的方法，觀察其對(duì)蘇云金芽孢桿菌的生長及蘇云金芽孢桿菌蛋白產(chǎn)量的影響，以期達(dá)到增加產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。結(jié)果表明：稀土離子對(duì)蘇云金芽孢桿菌生長有一定的促進(jìn)作用，對(duì)蘇云金芽孢桿菌蛋白有顯著增產(chǎn)效果。Sm3+、La3+、Y3+等3種稀土離子對(duì)蘇云金芽孢桿菌蛋白濕重的增產(chǎn)效果分別達(dá)到17.8％、43.8％、47.5％。許會(huì)才等[18]采用不同照射時(shí)間的紫外線(UV)對(duì)1株野生型蘇云金芽孢桿菌菌株及3株蘇云金芽孢桿菌菌株蘇云金芽孢桿菌001、蘇云金芽孢桿菌200、蘇云金芽孢桿菌087進(jìn)行照射處理后再置于32℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h，結(jié)果蘇云金芽孢桿菌野生菌株在UV處理3min后已基本全部失活，而蘇云金芽孢桿菌001、蘇云金芽孢桿菌200、蘇云金芽孢桿菌087在UV處理8 min后仍有活性。
W544是CrylAc蛋白上獨(dú)特于其它Cry類蛋白的一個(gè)氨基酸，它與F578和F604一起組成一個(gè)“螺旋槳狀”的疏水簇，通過疏水相互作用維持蛋白的三維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。王發(fā)祥[19]等通過研究將W544保守地替換成苯丙氨酸(F)，在不影響其活性的前提下，大大降低了CrylAc蛋白對(duì)紫外線的敏感性，同時(shí)還在一定程度上增強(qiáng)了其對(duì)蛋白酶的穩(wěn)定性。
申建茹[20]等利用PCR方法檢測viplA／vip2A基因在野生型蘇云金芽孢桿菌菌株中的分布，進(jìn)行基因片段的克隆和序列分析。結(jié)合cryl基因的PCR-RFIJP基因型鑒定體系，分析與rip1A／vip2A基因有聯(lián)系的cryl類基因。結(jié)果表明，分離保存的171株野生型蘇云金芽孢桿菌菌株中，有20株菌株含有viplA／vip2A基因，分布率為l1.69％。成功克隆了菌株蘇云金芽孢桿菌l6的viplA／vip2A基因片段，命名為viplA／vip2A16，GenBank登錄號(hào)為EU594327。cryl基因的PCR-RFLP鑒定結(jié)果表明，該20株菌株均含有crylFa基因，說明vota／v~2A基因與crylFa可能具有某種聯(lián)系。韓嵐嵐[21]等利用已克隆的5種BtCry基因Cry2Ab4、CrylIa8、CrylIel、Cry1Ca7、CrylCb2和1種野生茵株HD-73(CrylAc)表達(dá)的6種BtCry殺蟲晶體蛋白，對(duì)棉鈴蟲進(jìn)行生物活性分析，并將CrylAc殺蟲晶體蛋白分別與其它5種cry蛋白按1：1的比例組合，對(duì)棉鈴蟲進(jìn)行生物海}生測定。結(jié)果表明，單獨(dú)使用CrylAc時(shí)對(duì)棉鈴蟲活性最高，CrylAc與Cry2Ab4組合對(duì)棉鈴蟲也有較高的活性，CrylAc與這5種蛋白的組合對(duì)棉鈴蟲都有較高的毒力。
付祖姣[22]等采用脈沖電泳(Pulse field gelelectrophoresis，簡稱PFGE)，Southern雜交，PCR和PCR 產(chǎn)物限制性片段長度多態(tài)性分析體系(PCR andthe restriction fragment length polymorphism patterns of thePCR—amplified fragment，簡稱PCR—RFLP)對(duì)蘇云金芽孢桿菌4.0718菌株中cry基因的定位和類型進(jìn)行分析，闡述該菌株的遺傳背景，為該菌株的進(jìn)一步應(yīng)用打下基礎(chǔ)。
楊開杰[23]采用光密度法觀察蘇云金茅孢桿菌發(fā)酵過程，對(duì)培養(yǎng)液的pH值、培養(yǎng)溫度、含氧量和培養(yǎng)成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究。實(shí)驗(yàn)觀察到，蘇云金芽孢桿菌的最佳培養(yǎng)的條件是：在pH值為7.4，溫度為30℃的條件下，使用液體發(fā)酵培養(yǎng)基，以250次／分的振蕩頻率在恒溫震蕩器中培養(yǎng)36小時(shí)。楊超英[24]等采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)法和響應(yīng)面分析法對(duì)基于壓力脈動(dòng)周期刺激的蘇云金桿菌固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。利用SAS軟件對(duì)以啤酒糟為主要基質(zhì)的培養(yǎng)基中影響蘇云金桿菌毒力效價(jià)的主要因子進(jìn)行了評(píng)價(jià)，響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果表明最適培養(yǎng)基的組分(m／m)為：啤酒糟：玉米粉：豆粕粉：KH2PO4=100:2.19:15.41:0.22。在優(yōu)化培養(yǎng)基中，生物農(nóng)藥的毒力效價(jià)可達(dá)到8563IU／mg。劉雄恩[25]等為獲取蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)培養(yǎng)基的最優(yōu)配方，即玉米淀粉、黃豆餅粉、酵母粉、蛋白胨和魚粉等的最佳配比，運(yùn)用二次正交回歸旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)安排試驗(yàn)?；谠囼?yàn)數(shù)據(jù)、背景知識(shí)和遺傳算法的原理，進(jìn)一步設(shè)計(jì)了搜索蘇云金芽孢桿菌培養(yǎng)基最優(yōu)配方的算法，通過該算法搜索出該菌發(fā)酵培養(yǎng)基配方的最優(yōu)解區(qū)間。驗(yàn)證性的試驗(yàn)結(jié)果和分析表明，基于該遺傳算法的蘇云金芽孢桿菌培養(yǎng)基配方優(yōu)化的方法是有效且優(yōu)于傳統(tǒng)配方優(yōu)化方法的。
現(xiàn)今，蘇云金芽孢桿菌蘇云金芽孢桿菌制劑占據(jù)主要市場，約占整個(gè)微生物源農(nóng)藥的90％以上，其中半數(shù)在美國。在120多種蘇云金芽孢桿菌商品中，劑型多樣，有粉劑、可濕性粉劑、懸浮劑、濃水劑、油劑、油乳劑、顆粒劑、片劑、緩釋劑和生物包衣劑等。我國目前的劑型有粉劑、可濕性粉劑和懸浮劑等，對(duì)其他的劑型研究較少?，F(xiàn)在，在保護(hù)微生物殺蟲劑免受環(huán)境因素破壞方面，劑型的研究取得顯著成效，主要包括非水劑型的開發(fā)，紫外光保護(hù)劑的應(yīng)用，淀粉、海藻酸鹽膠囊劑的研制，抗雨沖刷劑和增效劑的開發(fā)與應(yīng)用和生物膠囊劑的研制等 。在國外許多公司都致力于農(nóng)藥微膠囊的研制，并已形成工業(yè)化生產(chǎn)，近年來，我國也有不少科研單位致力于生物農(nóng)藥、生化農(nóng)藥和微生物農(nóng)藥微膠囊的開發(fā)研制。美國科學(xué)家對(duì)蘇云金桿菌淀粉微膠囊劑進(jìn)行了一系列研究認(rèn)為，用淀粉將它作成微膠囊劑能提高它在田間條件下使用的穩(wěn)定性，并延長殘效期[26]。
5 存在問題及展望
蘇云金桿菌制劑作為微生物農(nóng)藥，要取代化學(xué)農(nóng)藥，除了依靠人們生態(tài)意識(shí)的提高，更要從技術(shù)上達(dá)到高效價(jià)、低成本、規(guī)模化，從選育菌種、降低培養(yǎng)基成本、提高發(fā)酵控制水平、減少后處理過程中毒效損失等各環(huán)節(jié)優(yōu)化。
蘇云金芽孢桿菌的基因的表達(dá)會(huì)發(fā)生變化。例如，如果溫度不理想，就可能降低毒素的產(chǎn)生，使植物易受侵蝕。更加嚴(yán)重的是，試驗(yàn)證明毒素減少的晚季植物會(huì)形成啟動(dòng)子的DNA甲基化。另外，毒素的持續(xù)使用會(huì)使普通害蟲演化為抗性蟲。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小菜蛾對(duì)蘇菌毒素的噴霧形式就已產(chǎn)生抗性。雖然轉(zhuǎn)蘇云金芽孢桿菌基因作物在土壤中的降解半衰期比較短[27]，但是蘇菌毒素的運(yùn)用還有一些可能的危險(xiǎn)，如：如果轉(zhuǎn)基因玉米與變異野草雜交，蘇菌基因的抗性就有可能因食物鏈來到食草動(dòng)物群落中，蜂群衰竭失調(diào)(CCD)，也可能跟蘇菌轉(zhuǎn)基因作物有關(guān)。
目前蘇云金桿菌的培養(yǎng)溫度多采用（30±1℃），溫度低于28℃發(fā)酵的周期會(huì)延長，但溫度超過37℃時(shí)伴孢晶體數(shù)量幾乎為零。蘇云金桿菌在對(duì)數(shù)生長期要消耗大量的氧氣，并相應(yīng)釋放出大量的熱量。如果中斷供氧，細(xì)胞停止生長，不能形成芽孢和晶體，最終導(dǎo)致細(xì)胞自溶。通氣量與供氧直接相關(guān)，增加通氣量和攪拌速度可以加速氧傳遞、代謝物質(zhì)的交換及熱量的釋放，具體的數(shù)值需根據(jù)發(fā)酵設(shè)備、容量、培養(yǎng)基成份和菌體不同的生長階段確定。
與化學(xué)農(nóng)藥相比，蘇云金桿菌制劑安全性增強(qiáng)，但產(chǎn)品的穩(wěn)定性差，殘效期短，殺蟲速度慢，而且受施用環(huán)境影響大[28]。我國對(duì)包括微膠囊劑在內(nèi)的有關(guān)調(diào)節(jié)有效釋放的劑型研究進(jìn)展緩慢，尚需進(jìn)一步加強(qiáng)。
隨著人們環(huán)保意識(shí)的不斷增強(qiáng)，加上微生物農(nóng)藥本身所具有的巨大優(yōu)勢(shì)，蘇云金芽孢桿菌及其制劑在未來的市場中必將占據(jù)很大的優(yōu)勢(shì)，具有很好的發(fā)展應(yīng)用前景。
