化學發(fā)光標記免疫分析又稱化學發(fā)光免疫分析(CL IA ) ,是用化學發(fā)光劑直接標記抗原或抗體的免疫分析方法?；瘜W發(fā)光免疫分析儀包含兩個部分， 即免疫反應系統(tǒng)和化學發(fā)光分析系統(tǒng)。化學發(fā)光分析系統(tǒng)是利用化學發(fā)光物質(zhì)經(jīng)催化劑的催化和氧化劑的氧化， 形成一個激發(fā)態(tài)的中間體， 當這種激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時， 同時發(fā)射出光子(hM) , 利用發(fā)光信號測量儀器測量光量子產(chǎn)額。免疫反應系統(tǒng)是將發(fā)光物質(zhì)（在反應劑激發(fā)下生成激發(fā)態(tài)中間體） 直接標記在抗原（化學發(fā)光免疫分析） 或抗體（免疫化學發(fā)光分析） 上， 或酶作用于發(fā)光底物。

化學發(fā)光免疫分析儀_化學發(fā)光免疫分析儀 -分類

化學發(fā)光標記免疫分析法

化學發(fā)光標記免疫分析又稱化學發(fā)光免疫分析(CL IA ) ,是用化學發(fā)光劑直接標記抗原或抗體的免疫分析方法。常用于標記的化學發(fā)光物質(zhì)有吖啶酯類化合物――acridin ium ester (A E) ,是有效的發(fā)光標記物[ 3 ] , 其通過起動發(fā)光試劑(N aOH2H2O 2 ) 作用而發(fā)光, 強烈的直接發(fā)光在一秒鐘內(nèi)完成,為快速的閃爍發(fā)光(見圖1)。吖啶酯作為標記物用于免疫分析, 其化學反應簡單、快速、無須催化劑; 檢測小分子抗原采用競爭法 ,大分子抗原則采用夾心法 , 非特異性結合少, 本底低; 與大分子的結合不會減小所產(chǎn)生的光量, 從而增加靈敏度。

發(fā)光酶免疫分析法

從標記免疫分析角度, 化學發(fā)光酶免疫分析( chem ilum inescen t enzym e imm unoassay,CL E IA ) , 應屬酶免疫分析, 只是酶反應的底物是發(fā)光劑,操作步驟與酶免分析完全相同[ 5 ]: 以酶標記生物活性物質(zhì)(如酶標記的抗原或抗體) 進行免疫反應, 免疫反應復合物上的酶再作用于發(fā)光底物,在信號試劑作用下發(fā)光, 用發(fā)光信號測定儀進行發(fā)光測定。目前常用的標記酶為辣根過氧化物酶(HRP) 和堿性磷酸酶(AL P) ,它們有各自的發(fā)光底物。

化學發(fā)光免疫分析儀_化學發(fā)光免疫分析儀 -發(fā)光試劑

HRP 標記的CLEIA常用的底物為魯米諾(32氨基鄰苯二甲酰肼,lum ino l) ,或其衍生物如異魯米諾(42氨基鄰苯二甲酰肼) , 是一類重要的發(fā)光試劑。其結構如圖4 所示。魯米諾的氧化反應在堿性緩沖液中進行,在過氧化物酶及活性氧[ 過氧化陰離子(O 2- ) , 單線態(tài)氧(1O 2 ) , 羥自由基(OH?) , 過氧化氫(H2O 2)]存在下,生成激發(fā)態(tài)中間體, 當其回到基態(tài)時發(fā)光, 其波長為425nm。

早期用魯米諾直接標記抗原(或抗體) ,但標記后發(fā)光強度降低而使靈敏度受到影響。近來用過氧化物酶標記抗體, 進行免疫反應后利用魯米諾作為發(fā)光底物, 在過氧化物酶和起動發(fā)光試劑(NaOH2H2O 2) 作用下, 魯米諾發(fā)光, 發(fā)光強度依賴于酶免疫反應物中酶的濃度。Kodak Am erliteTM半自動分析系統(tǒng)就是利用這一體系專門設計的。

化學發(fā)光免疫分析儀_化學發(fā)光免疫分析儀 -增強發(fā)光酶

增強發(fā)光酶免疫分析(enhanced luminescence enzyme immunoassay, ELEIA )在發(fā)光系統(tǒng)中加入增強發(fā)光劑, 如對2碘苯酚等, 以增強發(fā)光信號,并在較長時間內(nèi)保持穩(wěn)定, 便于重復測量, 從而提高分析靈敏度和準確性。在全自動分析儀上, 還可通過計算機嚴密控制, 進行自動操作, 如加試劑,混合, 溫育, 洗滌, 加發(fā)光試劑, 發(fā)光計數(shù), 數(shù)據(jù)處理, 繪制標準曲線, 直至完成病人血清樣品的分析并打印出結果。Am erliteTM發(fā)光增強酶免分析系統(tǒng)用熒光素、噻唑等增強劑, 其發(fā)光時間可持續(xù)長達20m in, 試劑盒有甲狀腺功能檢測的促甲狀腺素、三碘甲腺原氨酸、甲狀腺素、甲狀腺素結合球蛋白、游離甲狀腺素, 與性激素有關的有促黃體激素、促卵泡激素、人絨毛膜促性腺激素、甲胎蛋白、雌二醇、睪酮, 以及其他方面的如癌胚抗原、鐵蛋白、地高辛等。

ALP標記的CLEIA所用底物為環(huán)1, 22二氧乙烷衍生物, 這是一類很有前途的發(fā)光底物 ,用于化學發(fā)光酶免分析底物而設計的分子結構中包含起穩(wěn)定作用的基團――金剛烷基, 其分子中發(fā)光基團為芳香基團和酶作用的基團,在酶及起動發(fā)光試劑作用下引起化學發(fā)光。最常使用的底物是AM PPD [ 32(2’2 spiroadam an2tane ) 42methoxy242( 3’2 phosphoryloxy) 2phenyl21,22dioxetane ], 中文名為: 32(2’2螺金剛烷) 242甲氧基242(3’2 磷酰氧基) 2苯基21, 22環(huán)二氧乙烷)。在堿性磷酸酶(AL P) 作用下,磷酸酯基發(fā)生水解而脫去一個磷酸基, 得到一個中等穩(wěn)定的中間體AM PD (半壽期為2～ 30m in) ,此中間體經(jīng)分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移裂解為一分子的金剛烷酮和一分子處于激發(fā)態(tài)的間氧苯甲酸甲酯陰離子, 當其回到基態(tài)時產(chǎn)生470nm 的光,可持續(xù)幾十分鐘。AM PPD 為磷酸酯酶的直接化學發(fā)光底物,可用來檢測堿性磷酸酯酶或酶和抗體、核酸探針及其它配基的結合物?？蓹z測到堿性磷酸酯酶的濃度為10- 15mol/L 。

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