愛華網(wǎng)基因探針，即核酸探針，是一段帶有檢測標(biāo)記，且順序已知的，與目的基因互補(bǔ)的核酸序列(DNA或RNA)。基因探針通過分子雜交與目的基因結(jié)合，產(chǎn)生雜交信號(hào)，能從浩翰的基因組中把目的基因顯示出來。根據(jù)雜交原理，作為探針的核酸序列至少必須具備以下兩個(gè)條件：①應(yīng)是單鏈，若為雙鏈，必須先行變性處理。②應(yīng)帶有容易被檢測的標(biāo)記。它可以包括整個(gè)基因，也可以僅僅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之轉(zhuǎn)錄而來的RNA。
dna探針_基因探針 -簡要概述
基因探針化學(xué)發(fā)光檢測儀基因探針根據(jù)其來源有3種：
一種來自基因組中有關(guān)的基因本身，稱為基因組探針（genomic probe）；另一種是從相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄獲得了mRNA，再通過逆轉(zhuǎn)錄得到的探針，稱為cDNA 探針（cDNa probe）。與基因組探針不同的是，cDNA探針不含有內(nèi)含子序列。此外，還可在體外人工合成堿基數(shù)不多的與基因序列互補(bǔ)的DNA片段，稱為寡核苷酸探針。
探針的制備
進(jìn)行分子突變需要大量的探針拷貝，后者一般是通過分子克
基因探針?。╩olecular cloning）獲得的?？寺∈侵赣脽o性繁殖方法獲得同一個(gè)體、細(xì)胞或分子的大量復(fù)制品。當(dāng)制備基因組DNA探針進(jìn)，應(yīng)先制備基因組文庫，即把基因組DNA打斷，或用限制性酶作不完全水解，得到許多大小不等的隨機(jī)片段，將這些片段體外重組到運(yùn)載體（噬菌體、質(zhì)粒等）中去，再將后者轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞如大腸肝菌，這時(shí)在固體培養(yǎng)基上可以得到許多攜帶有不同DNA片段的克隆噬菌斑，通過原位雜交，從中可篩出含有目的基因片段的克隆，然后通過細(xì)胞擴(kuò)增，制備出大量的探針。
為了制備cDNA探針，首先需分離純化相應(yīng)mRNA，這從含有大量mRNA的組織、細(xì)胞中比較容易做到，如從造血細(xì)胞中制備α或β珠蛋白mRNA。有了mRNA作模板后，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，就可以合成與之互補(bǔ)的DNA(即cDNA)，cDNA與待測基因的編碼區(qū)有完全相同的堿基順序，但內(nèi)含子已在加工過程中切除。寡核苷酸探針是人工合成的，與已知基因DNA互補(bǔ)的，長度可從十幾到幾十個(gè)核苷酸的片段。如僅知蛋白質(zhì)的氨基酸順序量，也可以按氨基酸的密碼推導(dǎo)出核苷酸序列，并用化學(xué)方法合成。
探針的標(biāo)記
為了確定探針是否與相應(yīng)的基因組DNA雜交，有必要對(duì)探針加以標(biāo)記，以便在結(jié)合部位獲得可識(shí)別的信號(hào),通常采用放射性同位素32P標(biāo)記探針的某種核苷酸α磷酸基。但近年來已發(fā)展了一些用非同位素如生物素、地高辛配體等作為標(biāo)記物的方法。但都不及同位素敏感。非同位素標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)是保存時(shí)間較長,而且避免了同位素的污染。最常用的探針標(biāo)記法是缺口平移法(nick translation)。首先用適當(dāng)濃度的DNA酶Ⅰ（DNAseⅠ）在探針DNA雙鏈上造成缺口，然后再借助于DNA聚合酶Ⅰ（DNa poly merasⅠ）的5’→3’的外切酶活性，切去帶有5’磷酸的核苷酸；同時(shí)又利用該酶的5’→3’聚酶活性，使32P標(biāo)記的互補(bǔ)核苷酸補(bǔ)入缺口，DNA聚合酶Ⅰ的這兩種活性的交替作用，使缺口不斷向3’的方向移動(dòng)，同時(shí)DNA鏈上的核苷酸不斷為32P標(biāo)記的核苷酸所取代。
探針的標(biāo)記也可以采用隨機(jī)引物法，即向變性的探針溶液加入6個(gè)核苷酸的隨機(jī)DNA小片段，作為引物，當(dāng)后者與單鏈DNA互補(bǔ)結(jié)合后，按堿基互補(bǔ)原則不斷在其3’OH端添加同位素標(biāo)記的單核苷酸，這樣也可以獲得比放射性很高的DNA探針。
dna探針_基因探針 -DNA探針
熒光間接標(biāo)記dna探針檢測DNA探針是最常用的核酸探針，指長度在幾百堿基對(duì)以上的雙鏈DNA或單鏈DNA探針?，F(xiàn)已獲得DNA探針數(shù)量很多，有細(xì)菌、病毒、原蟲、真菌、動(dòng)物和人類細(xì)胞DNA探針。這類探針多為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。這些DNA片段須是特異的，如細(xì)菌的毒力因子基因探針和人類Alu探針。這些DNA探針的獲得有賴于分子克隆技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。以細(xì)菌為例，目前分子雜交技術(shù)用于細(xì)菌的分類和菌種鑒定比之G+C百分比值要準(zhǔn)確的多，是細(xì)菌分類學(xué)的一個(gè)發(fā)展方向。加之分子雜交技術(shù)的高敏感性，分子雜交在臨床微生物診斷上具有廣闊的前景。細(xì)菌的基因組大小約5×106bp，約含3000個(gè)基因。各種細(xì)菌之間絕大部分DNA是相同的，要獲得某細(xì)菌特異的核酸探針，通常要采取建立細(xì)菌基因組DNA文庫的辦法，即將細(xì)菌DNA切成小片段后分別克隆得到包含基因組的全信息的克隆庫。然后用多種其它菌種的DNA作探針來篩選，產(chǎn)生雜交信號(hào)的克隆被剔除，最后剩下的不與任何其它細(xì)菌雜交的克隆則可能含有該細(xì)菌特異性DNA片段。將此重組質(zhì)粒標(biāo)記后作探針進(jìn)一步鑒定，亦可經(jīng)DNA序列分析鑒定其基因來源和功能。因此要得到一種特異性DNA探針，常常是比較繁瑣的。探針DNA克隆的篩選也可采用血清學(xué)方法，所不同的是所建DNA文庫為可表達(dá)性，克隆菌落或噬斑經(jīng)裂解后釋放出表達(dá)抗原，然后用來源細(xì)菌的多克隆抗血清篩選陽性克隆，所得到多個(gè)陽性克隆再經(jīng)其它細(xì)菌的抗血清篩選，最后只與本細(xì)菌抗血清反應(yīng)的表達(dá)克隆即含有此細(xì)菌的特異性基因片段，它所編碼的蛋白是該菌種所特有的。用這種表達(dá)文庫篩選得到的顯然只是特定基因探針。
對(duì)于基因探針的克隆尚有更快捷的途徑。這也是許多重要蛋白質(zhì)的編碼基因的克隆方法。該方法的第一步是分離純化蛋白質(zhì)，然后測定該蛋白的氨基或羥基末端的部分氨基酸序列，然后根據(jù)這一序列合成一套寡核苷酸探針。用此探針在DNA文庫中篩選，陽性克隆即是目標(biāo)蛋白的編碼基因。值得一提的是真核細(xì)胞和原核細(xì)胞DNA組織有所不同。真核基因中含有非編碼的內(nèi)含子序列，而原核則沒有。因此，真核基因組DNA探針用于檢測基因表達(dá)時(shí)雜交效率要明顯低于cDNA探針。DNA探針（包括cDNA探針）的主要優(yōu)點(diǎn)有下面三點(diǎn)：①這類探針多克隆在質(zhì)粒載體中，可以無限繁殖，取之不盡，制備方法簡便。②DNA探針不易降解（相對(duì)RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。③DNA探針的標(biāo)記方法較成熟，有多種方法可供選擇，如缺口平移，隨機(jī)引物法，PCR標(biāo)記法等，能用于同位素和非同位素標(biāo)記。
DNA探針可以用來診斷寄生蟲病，現(xiàn)場調(diào)查及蟲種鑒定，可用于病毒性肝炎的診斷，遺傳性疾病的診斷，可用于改造變異的基因，可用于檢測飲用水病毒含量。具體方法：用一個(gè)特定的DNA片段制成探針，與被測的病毒DNA雜交，從而把病毒檢測出來。與傳統(tǒng)方法相比具有快速、靈敏的特點(diǎn)。傳統(tǒng)的檢測一次，需幾天或幾個(gè)星期的時(shí)間，精確度不高，而用DNA探針只需一天。據(jù)報(bào)道，能從1t水中檢測出10個(gè)病毒來，精確度大大提高。
dna探針_基因探針 -RNA探針
高辛標(biāo)記的rna探針RNA探針是一類很有前途的核酸探針，由于RNA是單鏈分子，所以它與靶序列的雜交反應(yīng)效率極高。早期采用的RNA探針是細(xì)胞mRNA探針和病毒RNA探針，這些RNA是在細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄或病毒復(fù)制過程中得到標(biāo)記的，標(biāo)記效率往往不高，且受到多種因素的制約。這類RNA探針主要用于研究目的，而不是用于檢測。例如，在篩選逆轉(zhuǎn)錄病毒人類免疫缺陷病毒（HIV）的基因組DNA克隆時(shí)，因無DNA探針可利用，就利用HIV的全套標(biāo)記mRNA作為探針，成功地篩選到多株HIV基因組DNA克隆。又如進(jìn)行中的轉(zhuǎn)錄分析（nuclearrunontranscrip－tionassay）時(shí)，在體外將細(xì)胞核分離出來，然后在α-32P-ATP的存在下進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，所合成mR－NA均摻入同位素而得到標(biāo)記，此混合mRNA與固定于硝酸纖維素濾膜上的某一特定的基因的DNA進(jìn)行雜交，便可反映出該基因的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，這是一種反向探針實(shí)驗(yàn)技術(shù)。
近幾年體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)不斷完善，已相繼建立了單向和雙向體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。該系統(tǒng)主要基于一類新型載體pSP和pGEM，這類載體在多克隆位點(diǎn)兩側(cè)分別帶有SP6啟動(dòng)子和T7啟動(dòng)子，在SP6RNA聚合酶或T7RNA聚合酶作用下可以進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄，如果在多克隆位點(diǎn)接頭中插入了外源DNA片段，則可以此DNA兩條鏈中的一條為模板轉(zhuǎn)錄生成RNA。這種體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)效率很高，在1h內(nèi)可合成近10μg的RNA產(chǎn)生，只要在底物中加入適量的放射性或生物素標(biāo)記的NTP，則所合成的RNA可得到高效標(biāo)記。該方法能有效地控制探針的長度并可提高標(biāo)記物的利用率。
值得一提的是，通過改變外源基因的插入方向或選用不同的RNA聚合酶，可以控制RNA的轉(zhuǎn)錄方向，即以哪條DNA鏈以模板轉(zhuǎn)錄RNA。這種可以得到同義RNA探針（與mRNA同序列）和反義RNA探針（與mRNA互補(bǔ)），反義RNA又稱cRNA，除可用于反義核酸研究外，還可用于檢測mRNA的表達(dá)水平。在這種情況下，因?yàn)樘结樅桶行蛄芯鶠閱捂?，所以雜交的效率要比DNA-DNA雜交高幾個(gè)數(shù)量級(jí)。RNA探針除可用于檢測DNA和mRNA外，還有一個(gè)重要用途，在研究基因表達(dá)時(shí)，常常需要觀察該基因的轉(zhuǎn)錄狀況。在原核表達(dá)系統(tǒng)中外源基因不僅進(jìn)行正向轉(zhuǎn)錄，有時(shí)還存在反向轉(zhuǎn)錄（即生成反義RNA），這種現(xiàn)象往往是外源基因表達(dá)不高的重要原因。另外，在真核系統(tǒng)，某些基因也存在反向轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生反義RNA，參與自身表達(dá)的調(diào)控。在這些情況下，要準(zhǔn)確測定正向和反向轉(zhuǎn)錄水平就不能用雙鏈DNA探針，而只能用RNA探針或單鏈DNA探針。
dna探針_基因探針 -探針標(biāo)記
質(zhì)粒的酶切分析探針是能與特異靶分子反應(yīng)并帶有供反應(yīng)后檢測的合適標(biāo)記物的分子。利用核苷酸堿基順序互補(bǔ)的原理，用特異的基因探針即識(shí)別特異堿基序列的有標(biāo)記的一段單鏈DNA（或RNA）分子，與被測定的靶序列互補(bǔ)，以檢測被測靶序列的技術(shù)叫核酸探針技術(shù)。探針制備就是將目的基因進(jìn)行標(biāo)記。特異性探針有三種形式――cDNA、RNA、寡核苷酸。cDNA和寡核苷酸是目前最常采用的探針。RNA探針用途很廣，也容易獲得，但其不穩(wěn)定性限制了其商業(yè)用途。cDNA探針的獲得是，將特定的基因片段裝載到質(zhì)粒或噬菌體中，經(jīng)過擴(kuò)增、酶切、純化等復(fù)雜的步驟，才能得到一定長度的cDNA探針。這一過程比較復(fù)雜，有相應(yīng)條件的實(shí)驗(yàn)室才能做到。寡核苷酸探針是在已知基因序列的情況下，由核酸合成儀來完成，可廉價(jià)獲得大量的此類探針。質(zhì)量也相對(duì)來說更為穩(wěn)定。由于cDNA探針長度通常為數(shù)百至數(shù)千個(gè)堿基，所以有良好的信號(hào)放大作用，但其滲透性比較差。寡核苷酸探針一般為十?dāng)?shù)個(gè)至數(shù)十個(gè)堿基，滲透性強(qiáng)，但信號(hào)放大作用則較差，合成的多相寡核苷酸探針，敏感性可以達(dá)到cDNA探針?biāo)健?p>探針的標(biāo)記方式有放射性標(biāo)記和非放射性標(biāo)記。標(biāo)記物質(zhì)有放射性元素（如32P等）和非放射性物質(zhì)（如生物素、地高辛等）。32P是最常用的核苷酸標(biāo)記同位素，被標(biāo)記的dNTP本身就帶有磷酸基團(tuán)，便于標(biāo)記。特點(diǎn)是比活性高，可達(dá)9000Ci/mmol；發(fā)射的β射線能量高。用它標(biāo)記的探針自顯影時(shí)間短，靈敏度高。32P的半壽期短，雖使用不方便，但為廢棄物的處理減輕了壓力。非放射性標(biāo)記法有酶標(biāo)法和化學(xué)物標(biāo)記法。酶標(biāo)方法與免疫測定ELISA方法相似，只是被標(biāo)記的核酸代替了被標(biāo)記的抗體，事實(shí)上被標(biāo)記的抗體也稱為探針，現(xiàn)有許多商品是生物素、地高辛標(biāo)記的。血凝素與生物素有非常高的親和性，當(dāng)血凝素標(biāo)記上過氧化物酶或堿性磷酸酶，經(jīng)雜交反應(yīng)最終形成探針-生物素-血凝素酶復(fù)合物（ABC法），酶催化底物顯色，觀察結(jié)果。ABC法底物顯色生成不溶物，以便觀測結(jié)果。酶標(biāo)記法復(fù)雜、重復(fù)性差，成本高，但便于運(yùn)輸、保存，靈敏度與放射物標(biāo)記法相當(dāng)。
探針標(biāo)記方法有：①缺口平移標(biāo)記法。利用的是DNA聚合酶I能修復(fù)DNA鏈的功能。該法先由DNaseI在DNA雙鏈上隨機(jī)切出切口，然后DNA聚合酶I沿缺口水解5′端核苷酸，同時(shí)在3′端修復(fù)加入被標(biāo)記核苷酸，切口平行推移。缺口平移法快速、簡便、成本相對(duì)較低、比活性相對(duì)較高、標(biāo)記均勻，多用于大分子DNA標(biāo)記，(>1000bp最好)，但單鏈DNA、RNA不能用該法標(biāo)記。②隨機(jī)引物法。隨機(jī)引物是指含有各種可能排列順序的寡聚核苷酸片斷的混合物，因此它可以與任意核苷酸序列雜交，起到聚合酶反應(yīng)的引物作用。將待標(biāo)記的DNA探針片斷變性后與隨機(jī)引物一起雜交，然后以此雜交的寡聚核苷酸為引物，在大腸桿菌DNA聚合酶I大斷段（KlenowFragment）催化下，合成與探針DNA互補(bǔ)的DNA鏈，當(dāng)在反應(yīng)體系中含有a-32P-dNTP時(shí)，即形成放射性同位素標(biāo)記的DNA探針。具有上述優(yōu)點(diǎn)，可代替缺口平移法。此外大小、單雙DNA均可標(biāo)記，標(biāo)記均勻，標(biāo)記率高，但也不能標(biāo)記環(huán)狀DNA。隨機(jī)引物法標(biāo)記探針一般長400~600bp。③末端標(biāo)記法（又叫尾標(biāo)）。利用末端轉(zhuǎn)移酶可進(jìn)行“尾標(biāo)”，尾標(biāo)適用于寡核苷酸探針標(biāo)記，寡核苷酸探針多用于核酸“點(diǎn)”突變的檢測，該探針可用核酸合成儀人工合成，克隆出的探針一般較長，特異性好，標(biāo)記量大，雜交的檢出信號(hào)強(qiáng)。
探針合成的注意事項(xiàng)有：①合成探針的長短，一般在20~50個(gè)核苷酸之間。合成過長成本高，且易出現(xiàn)聚合酶合成錯(cuò)誤，雜交時(shí)間長，合成太短則特異性下降。②堿基組成G-C應(yīng)含40%~60%，一種堿基連續(xù)重復(fù)不超過4個(gè)，以免非特異性雜交產(chǎn)生。③探針自身序列內(nèi)應(yīng)無互補(bǔ)區(qū)域，以免產(chǎn)生“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)，影響雜交。總之，一個(gè)好的探針最終要在實(shí)踐中才能加以確認(rèn)。
dna探針_基因探針 -實(shí)驗(yàn)應(yīng)用
探針濃度鑒定禽流感病毒核蛋白基因探針制備及其初步應(yīng)用
將禽流感病毒H9N2亞型毒株核蛋白(NP)基因3′端較為保守的、約350bp的編碼序列通過限制性內(nèi)切酶Hae?切割、分離后,用隨機(jī)引物法制備Digoxigenin2112dUTP標(biāo)記探針。測定該探針的濃度為100Lg?ml。特異性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該探針只能與實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的、含有NP基因的重組載體pGEM2TE2NP和pBacPAK2NP以及A型流感病毒H9N2亞型、H3N2亞型以及H9N3亞型毒株基因組RNA結(jié)合出現(xiàn)特異性的顏色反應(yīng),而與實(shí)驗(yàn)室常用的載體pGEM2Teasy、pBacPAK2His3、pTARGET和pGEMEX22以及新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒和傳染性喉氣管炎病毒基因組不發(fā)生反應(yīng)。應(yīng)用該探針檢測含NP基因的重組載體和重組病毒證明該探針是有效的,可用于含禽流感病毒樣品或材料的檢測。
DNA探針原位雜交
1、4―6微米切片，用防脫片膠（多聚賴氨酸）處理過的玻片貼附
2、56―60℃烤片2―16h
3、新鮮二甲苯脫蠟，10minX2（趁熱脫蠟）
4、100%乙醇5minX2次，不用浸水，直接空氣干燥
5、加入50μl蛋白酶K工作液（蛋白酶K用蒸餾水稀釋，濃度為25μg/ml），37℃消化10―15min
6、棄去蛋白酶K工作液，0.1MTBS洗滌3minX3次逐級(jí)酒精脫水（85%，95%，100%酒精）1minX3次然后空氣干燥
7、加入20μl探針，加蓋薄膜。（探針用預(yù)雜交液稀釋，濃度為5μg/ml）。
8、95℃變性10―12min；立刻置于冰塊上，防止復(fù)性。
9、37℃雜交16―20h
10、揭去薄膜，每張切片加入以下雜交后洗滌液：
>用2―3滴2XSSC37℃洗滌3minX2次；
>0.5XSSC37℃洗滌3minX2次；
>0.2XSSC37℃洗滌3minX2次；
11、0.1MPBS/TBS緩沖液洗滌，1minX3次
12、滴加小鼠抗地高辛生物素標(biāo)記的抗體工作液，37℃孵育45―60min；
13、0.1MPBS浸洗，5minX3次
14、滴加高敏堿性磷酸酶鏈親和素復(fù)合物工作液，37℃孵育45―60min。
15、0.1MPBS浸洗，5minX3次
16、滴加NBT/BCIP顯色6―16h，
17、雙蒸水終止反應(yīng)（37℃10min―2h），雙蒸水浸洗，5minX2次
18、滴加核固紅，30秒―5min；
19、雙蒸水浸洗，5minX3次
20、脫水、透明、封片
dna探針_基因探針 -相關(guān)詞條
基因蛋白質(zhì)葡萄糖動(dòng)物學(xué)核苷酸脂類生物學(xué)植物學(xué)dna探針_基因探針 -參考資料
[1] 北大附中附小 http://www.pkuschool.com/ask/q.asp?qid=173562[2]生物秀 http://www.bbioo.com/bio101/2007/19747.htm
[3] 時(shí)光網(wǎng) http://www.mtime.com/my/644225/blog/366095/
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