基因克隆是70年代發(fā)展起來的一項具有革命性的研究技術(shù)，可概括為∶分、切、連、轉(zhuǎn)、選。最終目的在于通過相應(yīng)技術(shù)手段，將目的基因?qū)爰闹骷毎?，在宿主細胞?nèi)目的基因被大量的復(fù)制?；蚩寺〖夹g(shù)的想法第一次出現(xiàn)在1972年11月在檀香山的一個有關(guān)質(zhì)粒的科學會議上?；蚩寺〖夹g(shù)包括了一系列技術(shù)，它大約建立于70年代初期。美國斯坦福大學的伯格（P.Berg）等人于1972年把一種猿猴病毒的DNA與λ噬菌體DNA用同一種限制性內(nèi)切酶切割后，再用DNA連接酶把這兩種DNA分子連接起來，于是產(chǎn)生了一種新的重組DNA分子，從此產(chǎn)生了基因克隆技術(shù)。

陽性克隆_基因克隆 -基本簡介

基因是細胞內(nèi)DNA分子上具有遺傳效應(yīng)的特定核苷酸序列的總稱，是具有遺傳效應(yīng)的DNA分子片段?；蚩刂频鞍踪|(zhì)合成，是不同物種以及同一物種的不同個體表現(xiàn)出不同的性狀的根本原因，即所謂"種瓜得瓜，種豆得豆"，"一母生九子，九子各不同"?；蛲ㄟ^DNA復(fù)制及細胞分裂把遺傳信息傳遞給下一代，并通過控制蛋白質(zhì)的合成使遺傳信息得到表達。

陽性克隆_基因克隆 -基因克隆

"切"是指用序列特異的限制性內(nèi)切酶切開載體DNA，或者切出目的基因；"連"是指用DNA連接酶將目的DNA同載體DNA連接起來，形成重組的DNA分子；"轉(zhuǎn)"是指通過特殊的方法將重組的DNA分子送入宿主細胞中進行復(fù)制和擴增；"選"則是從宿主群體中挑選出攜帶有重組DNA分子的個體?；蚬こ碳夹g(shù)的兩個最基本的特點是分子水平上的操作和細胞水平上的表達，而分子水平上的操作即是體外重組的過程，實際上是利用工具酶對DNA分子進行"外科手術(shù)"。

陽性克隆_基因克隆 -基因克隆技術(shù)

概述

基因克隆技術(shù)包括了一系列技術(shù)，它大約建立于70年代初期。美國斯坦福大學的伯格（P.Berg）等人于1972年把一種猿猴病毒的DNA與λ噬菌體DNA用同一種限制性內(nèi)切酶切割后，再用DNA連接酶把這兩種DNA分子連接起來，于是產(chǎn)生了一種新的重組DNA分子，從此產(chǎn)生了基因克隆技術(shù)。1973年，科恩（S.Cohen）等人把一段外源DNA片段與質(zhì)粒DNA連接起來，構(gòu)成了一個重組質(zhì)粒，并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，第一次完整地建立起了基因克隆體系。

一般來說，基因克隆技術(shù)包括把來自不同生物的基因同有自主復(fù)制能力的載體DNA在體外人工連接，構(gòu)建成新的重組DNA，然后送入受體生物中去表達，從而產(chǎn)生遺傳物質(zhì)和狀態(tài)的轉(zhuǎn)移和重新組合。因此基因克隆技術(shù)又稱為分子克隆、基因的無性繁殖、基因操作、重組DNA技術(shù)以及基因工程等。

采用重組DNA技術(shù)，將不同來源的DNA分子在體外進行特異切割，重新連接，組裝成一個新的雜合DNA分子。在此基礎(chǔ)上，這個雜合分子能夠在一定的宿主細胞中進行擴增，形成大量的子代分子，此過程叫基因克隆。

歷史

基因克隆技術(shù)的想法第一次出現(xiàn)在1972年11月在檀香山的一個有關(guān)質(zhì)粒的科學會議上。（質(zhì)粒是在細菌中發(fā)現(xiàn)的DNA環(huán)。質(zhì)粒攜帶某些對抗生素的耐藥性的基因。）一直在研究質(zhì)粒的史坦利?科恩，對赫伯特?博耶網(wǎng)站上的關(guān)于細菌酶切割DNA分子中的特定部分的介紹很感興趣。在一個深夜游覽威基基的一間熟食店兩位科學家相遇并談到將合作領(lǐng)域的科學知識相結(jié)合，構(gòu)思出了一個開創(chuàng)現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的實驗。到1973年初，他們推出了一系列的實驗，得到方法來選擇特定的外源基因在細菌中復(fù)制。

陽性克隆_基因克隆 -克隆過程概述

DNA的克隆是指在體外將含有目的基因或其它有意義的DNA片段同能夠自我復(fù)制的載體DNA連接，然后將其轉(zhuǎn)入宿主細胞或受體生物進行表達或進一步研究的分子操作的過程，因此DNA克隆又稱分子克隆，基因操作或重組DNA技術(shù)。DNA克隆涉及一系列的分子生物學技術(shù)，如目的DNA片段的獲得、載體的選擇、各種工具酶的選用、體外重組、導(dǎo)入宿主細胞技術(shù)和重組子篩選技術(shù)等等。

目的DNA片段的獲得

DNA克隆的第一步是獲得包含目的基因在內(nèi)的一群DNA分子，這些DNA分子或來自于目的生物基因組DNA或來自目的細胞mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成的雙鏈 cDNA分子。由于基因組DNA較大，不利于克隆，因此有必要將其處理成適合克隆的DNA小片段，常用的方法有機械切割和核酸限制性內(nèi)切酶消化。若是基因序列已知而且比較小就可用人工化學直接合成。如果基因的兩端部分序列已知，根據(jù)已知序列設(shè)計引物，從基因組DNA 或cDNA中通過PCR技術(shù)可以獲得目的基因。

載體的選擇

基因工程的載體應(yīng)具有一些基本的性質(zhì)：1）在宿主細胞中有獨立的復(fù)制和表達的能力，這樣才能使外源重組的DNA片段得以擴增。2）分子量盡可能小，以利于在宿主細胞中有較多的拷貝，便于結(jié)合更大的外源DNA片段。同時在實驗操作中也不易被機械剪切而破壞。3）載體分子中最好具有兩個以上的容易檢測的遺傳標記（如抗藥性標記基因），以賦予宿主細胞的不同表型特征（如對抗生素的抗性）。4）載體本身最好具有盡可能多的限制酶單一切點，為避開外源DNA片段中限制酶位點的干擾提供更大的選擇范圍。若載體上的單一酶切位點是位于檢測表型的標記基因之內(nèi)可造成插入失活效應(yīng)，則更有利于重組子的篩選。

DNA克隆常用的載體有：質(zhì)粒載體（plasmid），噬菌體載體（phage），柯斯質(zhì)粒載體（cosimid），單鏈DNA噬菌體載體（ssDNA phage ），噬粒載體（phagemid）及酵母人工染色體（YAC）等。從總體上講，根據(jù)載體的使用目的，載體可以分為克隆載體，表達載體，測序載體，穿梭載體等。

體外重組

體外重組即體外將目的片斷和載體分子連接的過程。大多數(shù)核酸限制性內(nèi)切酶能夠切割DNA分子形成有粘性末端，用同一種酶或同尾酶切割適當載體的多克隆位點便可獲得相同的粘性末端，粘性末端彼此退火，通過T4 DNA連接酶的作用便可形成重組體，此為粘末端連接。當目的DNA片斷為平端，可以直接與帶有平端載體相連，此為平末端連接，但連接效率比粘端相連差些。有時為了不同的克隆目的，如將平端DNA分子插入到帶有粘末端的表達載體實現(xiàn)表達時，則要將平端DNA分子通過一些修飾，如同聚物加尾，加銜接物或人工接頭，PCR法引入酶切位點等，可以獲得相應(yīng)的粘末端，然后進行連接，此為修飾粘末端連接。

導(dǎo)入受體細胞

載體DNA分子上具有能被原核宿主細胞識別的復(fù)制起始位點，因此可以在原核細胞如大腸桿菌中復(fù)制，重組載體中的目的基因隨同載體一起被擴增，最終獲得大量同一的重組DNA分子。

將外源重組DNA分子導(dǎo)入原核宿主細胞的方法有轉(zhuǎn)化（transformation），轉(zhuǎn)染（transfection），轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）。重組質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)化技術(shù)可以導(dǎo)入到宿主細胞中，同樣重組噬菌體DNA可以通過轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入。轉(zhuǎn)染效率不高，因此將重組噬菌體 DNA或柯斯質(zhì)粒體外包裝成有浸染性的噬菌體顆粒，借助這些噬菌體顆粒將重組DNA分子導(dǎo)入到宿主細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，這種轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)的導(dǎo)入效率要比轉(zhuǎn)染的導(dǎo)入效率高。

重組子的篩選

從不同的重組DNA分子獲得的轉(zhuǎn)化子中鑒定出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子即陽性克隆的過程就是篩選。發(fā)展起來的成熟篩選方法如下：

（一）插入失活法

外源DNA片段插入到位于篩選標記基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位點后，會造成標記基因失活，表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化子相應(yīng)的抗生素抗性消失或轉(zhuǎn)化子顏色改變，通過這些可以初步鑒定出轉(zhuǎn)化子是重組子或非重組子。常用的是β-半乳糖苷酶顯色法即藍白篩選法（白色菌落是重組質(zhì)粒）。

（二）PCR篩選和限制酶酶切法

提取轉(zhuǎn)化子中的重組DNA分子作模板，根據(jù)目的基因已知的兩端序列設(shè)計特異引物，通過PCR技術(shù)篩選陽性克隆。PCR法篩選出的陽性克隆，用限制性內(nèi)切酶酶切法進一步鑒定插入片段的大小。

（三）核酸分子雜交法

制備目的基因特異的核酸探針，通過核酸分子雜交法從眾多的轉(zhuǎn)化子中篩選目的克隆。目的基因特異的核酸探針可以是已獲得的部分目的基因片段,或目的基因表達蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物種的同源基因。

（四）免疫學篩選法

獲得目的基因表達的蛋白抗體，就可以采用免疫學篩選法獲得目的基因克隆。這些抗體即可是從生物本身純化出目的基因表達蛋白抗體，也可從目的基因部分ORF片段克隆在表達載體中獲得表達蛋白的抗體。

上述方法獲得的陽性克隆最后要進行測序分析，以最終確認目的基因。

陽性克隆_基因克隆 -最新科研報道

猛犸象或?qū)?fù)生俄韓聯(lián)手破譯基因嘗試克隆

這些保存完好的遺骸是2013年5月在俄羅斯薩哈共和國的永久凍土區(qū)發(fā)現(xiàn)的，已經(jīng)冰凍了約2.8萬年。

雅庫茨克猛犸象博物館負責人謝苗?格里戈里耶夫說：“假如樣本完好，那么通過協(xié)同研究，我們將能夠在一兩年內(nèi)破譯出首個猛犸象的核基因組?！?/p>

這位負責人表示：“今天的技術(shù)能夠做到這一點。這個工作是‘猛犸象復(fù)活’項目的一部分，該項目將從兩個方面實施。第一是通過搜尋活細胞并對其進行培養(yǎng)，然后進行克隆，第二則是根據(jù)人工的核基因培養(yǎng)出人造的活細胞?！?/p>

這些帶有毛發(fā)的完好遺骸，是在薩哈共和國的一個北極島嶼上發(fā)現(xiàn)的。在遺骸的軀干附近還發(fā)現(xiàn)了猛犸象的血液。分析結(jié)果顯示，這一遺骸屬于一只50到60歲之間的雌性猛犸象。

此次專題研討會的主題是研究化石的現(xiàn)代處理方法。專家小組負責人是韓國生物技術(shù)研究基金會的黃禹錫教授。

雅庫茨克一個新成立的實驗室將用先進方法來對提取的樣本進行分析。這是俄羅斯目前唯一以分子古生物學為研究方向的實驗室。

愛華網(wǎng)本文地址 » http://www.klfzs.com/a/8103230103/23808.html