Taq DNA聚合酶是從一種水生棲熱菌(Thermusaquaticus)yT1株分離提取的?yT是 一種嗜熱真細(xì)菌，能在70～75℃生長(zhǎng)?該菌是1969年從美國(guó)黃石國(guó)家森林公園火山溫泉中分離的。TaqDNA聚合酶是Mg2+依賴性酶，該酶的催化活性對(duì)Mg2+濃度非常敏感.以活性程度 很低的鮭魚精子DNA為模板，dNTP的濃度為0.7～0.8mmol/L時(shí)，用不同濃度Mg2+進(jìn)行 PCR反應(yīng)10min，測(cè)定結(jié)果為Mgcl2濃度在2.0mmol/L時(shí)該酶催化活性最高，此濃度能最 大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性，Mg2+過(guò)高就抑制酶活性，當(dāng)Mgcl2濃度在 10mmol/L時(shí)可抑制40～50%的酶活性.由于Mg2+能與dNTP結(jié)合而影響PCR反應(yīng)液中游離 的Mg2+濃度，因而Mgcl2的濃度在不同的反應(yīng)體系中應(yīng)適當(dāng)調(diào)整，優(yōu)化濃度.一般反應(yīng) 中Mg2+濃度至少應(yīng)比dNTP總濃度高0.5～1.0mmol/L.適當(dāng)濃度的KCL能使Taq DNA聚合 酶的催化活性提高50～60%，其最適濃度為50mmol/L，高于75mmol/L時(shí)明顯抑制該酶 的活性.

taq_TaqDNA聚合酶 -簡(jiǎn)介

Taq DNA聚合酶是從一種水生棲熱菌(Thermusaquaticus)yT1株分離提取的.yT是 一種嗜熱真細(xì)菌，能在70～75℃生長(zhǎng).該菌是1969年從美國(guó)黃石國(guó)家森林公園火山溫泉中分離的。該酶基因全長(zhǎng)2496個(gè)堿基，編碼832個(gè)氨基酸，酶蛋白分子為 94KDa.其比活性為200000單位/mg.75～80℃時(shí)每個(gè)酶分子每秒鐘可延伸約150個(gè)核苷 酸，70℃延伸率大于60個(gè)核苷酸/秒，55℃時(shí)為24個(gè)核苷酸/秒.溫度過(guò)高(90℃以上) 或過(guò)低(22℃)都可影響Taq DNA聚合酶的活性，該酶雖然在90℃以上幾乎無(wú)DNA合成， 但確有良好的熱穩(wěn)定性，在PCR循環(huán)的高溫條件下仍能保持較高的活性.在92.5℃、95℃ 、97.5℃時(shí)，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分別經(jīng)130min，40min和5～6min后，仍可 保持50%的活性，實(shí)驗(yàn)表明.PCR反應(yīng)時(shí)變性溫度為95℃～20sec，50個(gè)循環(huán)后，Taq DNA聚合酶仍有65%的活性.Taq DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性是該酶用于PCR反應(yīng)的前提條 件，也是PCR反應(yīng)能迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用的原因.Taq DNA聚合酶還具有逆轉(zhuǎn)錄活性， 其作用于類似逆轉(zhuǎn)錄酶.此活性溫度一般為65～68℃，有Mn2+存在時(shí)，其逆轉(zhuǎn)錄活性 更高.

taq_TaqDNA聚合酶 -催化活性

TaqDNA聚合酶是Mg2+依賴性酶，該酶的催化活性對(duì)Mg2+濃度非常敏感.以活性程度 很低的鮭魚精子DNA為模板，dNTP的濃度為0.7～0.8mmol/L時(shí)，用不同濃度Mg2+進(jìn)行 PCR反應(yīng)10min，測(cè)定結(jié)果為Mgcl2濃度在2.0mmol/L時(shí)該酶催化活性最高，此濃度能最 大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性，Mg2+過(guò)高就抑制酶活性，當(dāng)Mgcl2濃度在 10mmol/L時(shí)可抑制40～50%的酶活性.由于Mg2+能與dNTP結(jié)合而影響PCR反應(yīng)液中游離 的Mg2+濃度，因而Mgcl2的濃度在不同的反應(yīng)體系中應(yīng)適當(dāng)調(diào)整，優(yōu)化濃度.一般反應(yīng) 中Mg2+濃度至少應(yīng)比dNTP總濃度高0.5～1.0mmol/L.適當(dāng)濃度的KCL能使Taq DNA聚合 酶的催化活性提高50～60%，其最適濃度為50mmol/L，高于75mmol/L時(shí)明顯抑制該酶 的活性.

taq_TaqDNA聚合酶 -校對(duì)活性

該酶無(wú)校對(duì)活性，易產(chǎn)生錯(cuò)配堿基。

TaqDNA聚合酶的種類

a，保真性的一個(gè)通用標(biāo)準(zhǔn)是錯(cuò)配率，錯(cuò)配率越低保真性越好。普通 Taq 酶的錯(cuò)配率在 10 -5 堿基 / 循環(huán)數(shù)，而高保真 Taq 酶錯(cuò)配率可降到 10 -6 數(shù)量級(jí)，大大降低了出錯(cuò)的可能性；它適合對(duì) PCR 保真性要求較高的實(shí)驗(yàn)，如基因篩選、測(cè)序、突變檢測(cè)等等。高保真 Taq 酶的保真原理是：高保真 Taq 酶具有 3‘ 到 5’ 核酸外切酶的活性。市面上主要有兩類產(chǎn)品：一類是混合型的高保真酶，將帶有 Proofreading 活性的酶與普通 Taq 酶（用于提高擴(kuò)增效率）混合起來(lái)；另一類是單一型的高保真酶。

b，熱啟動(dòng)Taq酶（高特異Taq酶）：在 PCR 第一個(gè)循環(huán)變性之前，有一個(gè)升溫的過(guò)程，引物和模板會(huì)有一些非特異性配對(duì)，如果這時(shí) Taq 酶發(fā)揮活性，就很容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，由于循環(huán)初期模板量非常少，產(chǎn)生的非特異性條帶經(jīng)過(guò)后面的指數(shù)擴(kuò)增，就會(huì)嚴(yán)重干擾目的片段的擴(kuò)增，甚至導(dǎo)致特異性條帶不能擴(kuò)出；而熱啟動(dòng) Taq 酶是必需經(jīng)過(guò)高溫才能激活的酶，因此在初始循環(huán)的變性之前它沒(méi)有活性，不會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，這就大大提高了 PCR 擴(kuò)增的特異性。

c，高耐熱Taq酶： 對(duì)于有些模板變性溫度較高，需要時(shí)間較長(zhǎng)，可能要求高耐熱性 Taq 酶，如 NEB 公司的 Vent 和 Deep Vent DNA 聚合酶系列，兩者都是從海底火山口分離出來(lái)后克隆的，是普通 Taq 酶耐熱性的三倍以上，前者在 95°C 半衰期近 7 小時(shí)， 100°C 近 2 小時(shí)；而后者分別為 23 小時(shí)和 8 小時(shí)。

d，超長(zhǎng)片段擴(kuò)增Taq酶:對(duì)于作基因組圖譜、測(cè)序及分子遺傳學(xué)研究的科研人員，可能會(huì)用到超長(zhǎng)片段的擴(kuò)增， Clontech 公司的 Advantage Genomic 系列混有 Tth DNA 聚合酶， Proofreading 酶和熱啟動(dòng)抗體，對(duì)復(fù)雜模板可擴(kuò)增 10kb 片段，簡(jiǎn)單模板可達(dá) 40kb 。

?

愛(ài)華網(wǎng)本文地址 » http://www.klfzs.com/a/8103220103/20123.html