原位雜交，是指將標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱為原位雜交。

核酸雜交_原位雜交 -概述

將標(biāo)記的核酸探針與細(xì)胞或組織中的核酸進(jìn)行雜交，稱為原位雜交！使用DNA或者RNA探針來(lái)檢測(cè)與其互補(bǔ)的另一條鏈在細(xì)菌或其他真核細(xì)胞中的位置。

RNA原位核酸雜交又稱RNA原位雜交組織化學(xué)或RNA原位雜交。該技術(shù)是指運(yùn)用cRNA或寡核苷酸等探針檢測(cè)細(xì)胞和組織內(nèi)RNA表達(dá)的一種原位雜交技術(shù)。其基本原理是：在細(xì)胞或組織結(jié)構(gòu)保持不變的條件下，用標(biāo)記的已知的RNA核苷酸片段，按核酸雜交中堿基配對(duì)原則，與待測(cè)細(xì)胞或組織中相應(yīng)的基因片段相結(jié)合(雜交)，所形成的雜交體(Hybrids)經(jīng)顯色反應(yīng)后在光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡下觀察其細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA原位雜交技術(shù)經(jīng)不斷改進(jìn)，其應(yīng)用的領(lǐng)域已遠(yuǎn)超出DNA原位雜交技術(shù)。尤其在基因分析和診斷方面能作定性、定位和定量分析，已成為最有效的分子病理學(xué)技術(shù)，同時(shí)在分析低豐度和罕見(jiàn)的mRNA表達(dá)方面已展示了分子生物學(xué)的一重要方向。

核酸雜交_原位雜交 -原位雜交原理

原位雜交技術(shù)的基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基序列，將有放射性或非放射性的外源核酸(即探針)與組織、細(xì)胞或染色體上待測(cè)DNA或RNA互補(bǔ)配對(duì)，結(jié)合成專一的核酸雜交分子，經(jīng)一定的檢測(cè)手段將待測(cè)核酸在組織、細(xì)胞或染色體上的位置顯示出來(lái)。為顯示特定的核酸序列必須具備3個(gè)重要條件：組織、細(xì)胞或染色體的固定、具有能與特定片段互補(bǔ)的核苷酸序列(即探針)、有與探針結(jié)合的標(biāo)記物(曾呈奎等2000)。

RNA原位核酸雜交又稱RNA原位雜交組織化學(xué)或RNA原位雜交。該技術(shù)是指運(yùn)用cRNA或寡核苷酸等探針檢測(cè)細(xì)胞和組織內(nèi)RNA表達(dá)的一種原位雜交技術(shù)。其基本原理是：在細(xì)胞或組織結(jié)構(gòu)保持不變的條件下，用標(biāo)記的已知的RNA核苷酸片段，按核酸雜交中堿基配對(duì)原則，與待測(cè)細(xì)胞或組織中相應(yīng)的基因片段相結(jié)合(雜交)，所形成的雜交體(Hybrids)經(jīng)顯色反應(yīng)后在光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡下觀察其細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA原位雜交技術(shù)經(jīng)不斷改進(jìn)，其應(yīng)用的領(lǐng)域已遠(yuǎn)超出DNA原位雜交技術(shù)。尤其在基因分析和診斷方面能作定性、定位和定量分析，已成為最有效的分子病理學(xué)技術(shù)，同時(shí)在分析低豐度和罕見(jiàn)的mRNA表達(dá)方面已展示了分子生物學(xué)的一重要方向。

組織診斷在許多生命中扮演著至關(guān)重要的作用，專注于質(zhì)量、速度和效率將會(huì)產(chǎn)生很大的變化。 原位雜交離不開(kāi)染色，高級(jí)染色的各個(gè)方面，以及量身定制解決方案所需的選件,都整合到IHC和ISH染色之中。

核酸雜交_原位雜交 -實(shí)驗(yàn)步驟

一、質(zhì)粒制備

1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增
1.1制備XL1-Blue感受態(tài)細(xì)菌
1．取400uLXL1-Blue菌種加入到含200mlLB培養(yǎng)基的錐形瓶中，37℃、100rpm培養(yǎng)4h，離心，倒置，以冰冷的0.1mol／LCaCl_2重懸細(xì)菌，冰浴30min，離心，棄上清，倒置，再加4ml(含15％甘油)冰冷的CaCl2重懸細(xì)菌，分裝(200μ／tube)，-80℃保存。
2．轉(zhuǎn)化：在冰浴中將1管XL1-Blue感受態(tài)菌解凍，將濃度為2ng／μ1的質(zhì)粒DNA4μ1加入到8Oμ1感受態(tài)菌中。
3．輕輕搖勻，冰浴30min。
4．42℃熱激9O秒，然后迅速冰浴2min。
5．加入LB培養(yǎng)液(無(wú)氨芐青霉素)0.8ml，在37℃，100轉(zhuǎn)／min水浴孵育60min。
6．取200μl菌液鋪于瓊脂板上(涂有X-Gal(20mg／ml)-IPTG(200mg／ml)的LB-氨芐青霉素50mg／ml,1μl／ml培養(yǎng)基)，待菌液全部被吸收后，倒置平板于37℃培養(yǎng)12-16h。
1.2鑒定和挑選含重組質(zhì)粒的菌落
1．用無(wú)菌牙簽挑取單菌落，接種到10ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液的離心管中，于37℃，200轉(zhuǎn)／分培養(yǎng)2h，取1ml之一EPPENDORF離心管，加50μl10mmol／LEDTA(pH8.0)。
2．加入50μl新配置的0.2mol／LNaOH、0.5％SDS、20％蔗糖溶液后，振蕩30秒。
3．在70℃溫育5min，然后冷卻到室溫。
4．加1.5μ14mol／LKCl和0.5μ1含0.4％溴酚蘭染液，振蕩3O秒后，冰浴5min。
5．12000g，4℃離以3min，以除去細(xì)菌碎片。
6．制備1％的瓊脂糖凝膠(含EB0.5μg／ml)，取50μl上清液加入到樣品孔中，其中一孔加入中等分子量DNAMarker。恒壓50V，進(jìn)行電泳。
7．當(dāng)溴酚蘭遷移到凝膠全長(zhǎng)的2／3-3／4時(shí)，停止電泳，在紫外燈下檢查質(zhì)粒DNA分于量的大小是否與轉(zhuǎn)入質(zhì)粒相符。
1.3質(zhì)粒的擴(kuò)增和純化
1．用無(wú)菌牙簽分別挑取單個(gè)白色菌落移入含30mlLB-氨芐青霉素(50μg／ml)培養(yǎng)液的聚丙烯管中，于37℃，200轉(zhuǎn)／分培養(yǎng)3h。
2．將菌液轉(zhuǎn)入含70mlLB-氨芐青霉素培養(yǎng)液的250ml錐形瓶中，37℃，200轉(zhuǎn)／分培養(yǎng)過(guò)夜(12-16h)，細(xì)菌渾濁。
3.菌液中加入氯霉素液(34mg溶于lml乙醇，100ml菌液加入0.5ml氯霉素溶液，終濃度為170μ／ml)。37℃，200轉(zhuǎn)／分培養(yǎng)12-16h。
4.將培養(yǎng)的細(xì)菌倒入50ml的離心管中，6000rpm，4℃離,th,15min，沉淀細(xì)菌。
5.棄凈上清夜，用2ml預(yù)冷的溶液I，懸浮菌體沉淀，劇烈振蕩，于室溫靜置5min
6.加入新配制的溶液II4ml，快速用手晃動(dòng)10秒，顛倒數(shù)次后，于室溫靜置10min。
7.加入預(yù)冷的溶液III3ml，溫和振蕩l0秒，于冰上靜置10min，出現(xiàn)白色絮狀沉淀。
8．6000rpm，4℃離心15min，保留上清。
9．將上清(若帶細(xì)菌殘片，則再次離心)移入另一50ml的離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇混勻，于室溫靜置10min。(或-20℃4h，或4℃過(guò)夜，可便核酸沉淀)
10.12000rpm，4℃離心15min，回收核酸。小心棄去上清，倒置離心管使殘兼上清液流盡。
11．于室溫用70％的乙醇洗滌沉淀物和管壁，室溫12000rpm離心，15min，充分棄去乙醇，于室溫將離心管倒置在紙巾上，使最后殘余的痕量乙醇揮發(fā)殆盡。
12．用500μlTE(pH8.0)溶解核酸沉淀，轉(zhuǎn)移至1.5mlEppendorf管中。
13．加入用冰預(yù)冷的5mol／L的LiCl溶液600μl，充分混勻。12000rpm，4℃離心15min，以沉淀高分子量的RNA。
14.將上清轉(zhuǎn)移到另一1.5mlEppendorf管中，加等量異丙醇，充分混勻，于室溫靜置10min。
15.12000rpm,4℃離心15min，回收核酸。小心棄去上清，倒置離心管使殘余上清液流盡。
16．于室溫用70％的乙醇洗滌沉淀物和管壁，室溫12000rpm離心，15min，充分棄去乙醇，于室溫將離心管倒置在紙巾上，使最后殘余的痕量乙醇揮發(fā)殆盡。
17.400μl含無(wú)DNA酶的RNA酶(20μg/ml)的TE緩沖液(pH8.0)溶解沉淀，將溶液轉(zhuǎn)移到另－1.5mlEppendorf管中，室溫放置1.5mlEppendorf管中30min。
18．加入400μl13％(v／v)的PEG8000-NaCl(1.6mol／L)，混勻，4℃12000rpm離心5min以回收質(zhì)粒DNA，棄去上清。
19．加入400μlTE緩沖液(pH8.O)溶解沉淀，再分別用等體積的Tris飽和酚、酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)、和氯仿各抽提一次。
20．將水相(上清)移入另一1.5mlEppendorf管中，加入O.1體積(約50μ13M的醋酸鈉(pH5.2)和2倍體積(大約1ml)的無(wú)水乙醇，充分混勻后于4℃放置30min。
21．于4℃12000rpm離心5min回收沉淀的質(zhì)粒DNA。盡可能棄去上清，敞開(kāi)管口，置工作臺(tái)上使殘留的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。
22．加入400μl處于4℃的70％乙醇，稍加振蕩，漂洗沉淀，4℃12000rpm離心2min。
23．吸去上清，室溫敞開(kāi)管口，直到乙醇完全揮發(fā)。
24．用100μlTE緩沖液(pH8.0)溶解沉淀。
25．取4μl溶液1：100稀釋后，測(cè)定其OD260、OD280，以確定質(zhì)粒DNA的純度和濃度(OD260／OD280>1.8。OD260／OD280對(duì)DNA而言其值大約為
1.8，高于2.0則可能有RNA污染，低于1.8則有蛋白質(zhì)污染。；DNA濃度=OD260X0.05X稀釋倍數(shù)(μg／μl)。
26．質(zhì)粒DNA溶液于-20℃保存待用。

二、cRNA探針的標(biāo)記

1．將質(zhì)粒DNA，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶線性化，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳以確保完全線性化。
2．線性化后的DNA按“質(zhì)粒的純化”步驟19-24進(jìn)行純化，作為cRNA探針標(biāo)記的模板，用相應(yīng)的RNA聚合酶合成地高辛標(biāo)記的反義和正義RNA探針。
3．進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，步驟如下：
4．在冰上將各試劑加入一1.5ml無(wú)RNA酶的Eppendorf管中。DEPC處理的三蒸水8μl
質(zhì)粒DNA模板0.05μg／μl1μl
10xNTP地高辛標(biāo)記混合物1x2μl
0.1MDTT溶液10mM2μl
5x轉(zhuǎn)錄緩沖液1x4μl
RNAse抑制劑2U／μl1μl
RNA聚合酶2U/μl2μl
反應(yīng)體系總體積20μl
5．加入上述各試劑后，混勻，簡(jiǎn)短離心后在37℃孵育2h。
6．加入2μl無(wú)RNA酶的DNA酶I(10U／μ1)，37℃孵育15min降解模板DNA。
7．加入0.2MEDTA(pH8.0)溶液2μl終止反應(yīng)。
8．加入2.5μl的4MLicl和7.5μl冷的無(wú)水乙醇，混勻，-20℃放置2h。
9．12000g下離以15min，棄上清，小心地用50μl冷的70％乙醇洗滌沉淀。
10．室溫下稍干燥，溶于100μ1DEPC處理過(guò)的三蒸水中，混勻分裝，-20℃下保持備用。

三、原位雜交

3.1冰凍切片與雜交前預(yù)處理
1．將子宮樣品從-80℃取出，用OCT包埋，在-23℃(切片機(jī)腔體溫度)平衡至少30min。將包埋好的樣品固定在樣品頭上，切10μm厚的連續(xù)組織切片，平鋪于涂有多聚賴氨酸(1mg／m1)的玻片上(玻片預(yù)先經(jīng)180℃干烤6小時(shí))，保存于-70℃冰柜備用。
2．冰凍切片經(jīng)室溫干燥10min后，在4％的多聚甲醛-PBS(pH7.4)固定l0min。
3．活躍的DEPC-PBS(未高壓的0.1％DEPC-1XPBS溶液)洗2次，每次5min。
4．在0.2M的鹽酸作用中作用10min后，重復(fù)步驟4)。
5．在切片上滴加蛋白酶K(0.1μg／m1)，37℃孵育15min，重復(fù)步驟4)。
6．經(jīng)0.1MTEA(三乙醇胺)作用5min后，再在新配制的0.25％AA／0.1MTEA(乙酸酐／三乙醇胺，pH8.0)中乙?；?0min。(在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中，步驟4，5，6省略)
7．5xSSC中平衡15min。
3.2雜交
8．在脫水后的玻片上滴加預(yù)雜交液(約100μl／玻片)，置于放有濕盒液(50％甲酰胺v／v；0.3MNaCl；1MmEDTA；10mMTris-Cl，pH8.O)的濕盒中，55～58℃下的烘箱中預(yù)雜交2h。
9．甩掉預(yù)雜交液，地高辛標(biāo)記的反義或正義cRNA探針(濃度1-2ng／μl)經(jīng)70℃變性1O分鐘，置冰上1min，玻片上滴加預(yù)雜交液(約60μl／玻片)，覆蓋parafilm膜，放濕盒中在48～58℃下雜交18-30h。
3.3雜交后處理
10．取出玻片，小心去掉Parafilm膜，甩掉雜交液，用52℃預(yù)熱的5×SSC洗30min。
11．在無(wú)DNA的RNA酶A(20μg／ml)溶液中37℃下孵育30min。
12．分別依次用52℃預(yù)熱的2XSSC，1XSSC和O.1XSSC洗2次，每次30min。
3.4雜交信號(hào)檢測(cè)
13．在緩沖液A(0.1MTris-HC1pH7.5，0.15MNaC1)中平衡5min。
14．在玻片上滴加堿性磷酸酶的抗地高辛抗體(1：500～1:2000稀釋于含0.5％阻斷液的緩沖液A中)，室溫反應(yīng)2h。
15．用緩沖液A洗2次，每次15min。
16．在緩沖液B(0.1MTris-HCl；0.1MNaCl；0.05MMgCl_2，pH9.5)中平衡5min。
17．硝基四氮唑藍(lán)(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚氧磷酸鹽(BCIP)溶于緩沖液B中，每ml緩沖液B含有4.5μ1NBT和3.5μ1BCIP。在玻片上滴加混合染液在濕盒中顯色過(guò)夜。
18．充分顯色后，用EDTA(1mMEDTA，pH8.0)洗15min終止反應(yīng)。
19．在95％乙醇中洗lh以除去非特異的背景。
20．用蒸餾水洗15min除去可能存在的結(jié)晶體。
21．脫水、透明，用中性樹(shù)膠封片。
22．充分干燥后在顯微鏡下觀察、照相。

核酸雜交_原位雜交 -雜交前固定

原位雜交組織化學(xué)技術(shù)（InSituHybridizationHistochemistry,ISHH）在固定劑的應(yīng)用和選擇上應(yīng)兼顧到三個(gè)方面：保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，最大限度地保持細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA的水平；使探針易于進(jìn)入細(xì)胞或組織。DNA是比較穩(wěn)定的，mRNA是相對(duì)穩(wěn)定的但易為酶合成和降解。RNA卻絕然不同，非常容易被降解。因此，對(duì)于DNA的定位來(lái)說(shuō)，固定劑的種類和濃度并不十分重要。相反，在RNA的定位上，如果要使RNA的降解減少到最低限度，那么，不僅固定劑的種類濃度和固定的時(shí)間十分重要，而且取材后應(yīng)盡快予以冷凍或固定。在解釋ISHH的結(jié)果時(shí)應(yīng)考慮到取材至進(jìn)入固定劑或冰凍這段時(shí)間對(duì)RNA保存所帶來(lái)的影響，因組織中mRNA的降解是很快的。在固定劑中，最常用的是多聚甲醛。和其它的固定劑（如戊二醛）不同，多聚甲醛不會(huì)與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，因而不會(huì)影響探針穿透入細(xì)胞或組織。

其它如醋酸-酒精的混合液和Bouin’s固定劑也能獲得較滿意的效果。對(duì)于mRNA的定位，我們常采用的方法是將組織固定于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中1～2h，在冷凍前浸入15%蔗糖溶液中，置4℃冰箱過(guò)夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片機(jī)或振蕩切片機(jī)切片。組織也可在取材后直接置入液氮冷凍，切片后才將其浸入4%多聚甲醛約10min，空氣干燥后保存在-70℃。如冰箱溫度恒定，在-70℃可保存數(shù)月之久不會(huì)影響雜交結(jié)果。在病理學(xué)活檢取材多用福爾馬林固定和石蠟包埋，這種標(biāo)本對(duì)檢測(cè)DNA和mRNA有時(shí)也可獲得雜交信號(hào)，但石蠟包埋切片由于與蛋白質(zhì)交叉連接的增加，影響核酸探針的穿透，因而雜交信號(hào)常低于冰凍切片。同時(shí)，在包埋的過(guò)程中可減低mRNA的含量。

其它固定劑如應(yīng)用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷凍切片也可獲得滿意效果。各種固定劑均有各自優(yōu)缺點(diǎn)，如沉淀性（Precipitating）固定劑：酒精/醋酸混合液、Bouin’s液、Carnoy’s液等能為增加核酸探針的穿透性提供最佳條件，但它們不能最大限度地保存RNA，而且對(duì)組織結(jié)構(gòu)有損傷。戊二醛能較好地保存RNA和組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，但由于和蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接，從而大大地影響了核酸探針的穿透性。至今，多聚甲醛仍被公認(rèn)為ISHH較為理想的固定劑。

核酸雜交_原位雜交 -玻片和組織切片的處理

1．玻片的處理。玻片包括蓋片和載片應(yīng)用熱肥皂刷洗，自來(lái)水清洗干凈后，置于清潔液中浸泡24h，清水洗凈烘干，95%酒精中浸泡24h后蒸餾水沖洗、烘干，烘箱溫度最好在150℃或以上過(guò)夜以去除任何RNA酶。蓋玻片在有條件時(shí)最好用硅化處理，錫箔紙包裹無(wú)塵存放。由于ISHH的實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)程序繁雜，因此，要應(yīng)用粘附劑預(yù)先涂抹在玻片上，干燥后待切片時(shí)應(yīng)用，以保證在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中切片不致脫落。常用的粘附劑有鉻礬-明膠液，其優(yōu)點(diǎn)是價(jià)廉易得，但在長(zhǎng)周期實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，粘附效果不夠理想。多聚賴氨酸液具有較好的粘附效果，但價(jià)格昂貴，需進(jìn)口。

2．增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性。此步驟根據(jù)應(yīng)用固定劑的種類、組織的種類、切片的厚度和核酸探針的長(zhǎng)度而定。比如用戊二醛固定的組織由于其與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接就需要應(yīng)用較強(qiáng)的增強(qiáng)組織通透性的試劑。增強(qiáng)組織通透性常用的方法如應(yīng)用稀釋的酸洗滌、去垢劑（detergent）或稱清洗劑TritonX-100、酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶和淀粉酶（diastase）等。這種廣泛的去蛋白作用無(wú)疑可增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性，提高雜交信號(hào)，但同時(shí)也會(huì)減低RNA的保存最和影響組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)，因此，在用量及孵育時(shí)間上應(yīng)慎為掌握。

蛋白酶K（ProteinaseK）的消化作用在ISHH中是應(yīng)用于蛋白消化的關(guān)鍵步驟，其濃度及孵育時(shí)間視組織種類、應(yīng)用固定劑種類、切片的厚薄而定。一般應(yīng)用酶K1μg/ml(于0.1mol/LTris/50mmol/LEDTA,pH8.0緩沖液中),37℃孵育15～20min，以達(dá)到充分的蛋白消化作用而不致影響組織的形態(tài)為目的。蛋白酶K還具有消化包圍著靶DNA的蛋白質(zhì)的作用，從而提高雜交信號(hào)。在蛋白酶K消化后，應(yīng)用0.1mol/L的甘氨酸溶液（在PBS中）清洗以終止蛋白酶K的消化作用，甘氨酸是蛋白酶K的抑制劑。為保持組織結(jié)構(gòu)，通常用4%多聚甲醛再固定。Burns等（1987）報(bào)告應(yīng)用胃蛋白酶（pepsin）20～100μg/ml（用0.1NHCl配）37℃、30min進(jìn)行消化，所獲實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)于蛋白酶K。

不少實(shí)驗(yàn)工作者在多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐（aceticanhydride）和三乙醇胺（tri－ethanolamine）中以減低靜電效應(yīng)，減少探針對(duì)組織的非特異性背景染色。有的作者除在室溫下浸于上述溶液10min外，還在預(yù)熱37℃的50%甲酰胺/2×SSC液中預(yù)雜交15min，然后用2×SSC，0.30mol/LNaAc/0.030mol/L枸櫞酸鈉液中浸15min。但Heinz、Hofer等一些著名學(xué)者卻對(duì)此持有異議，根據(jù)他們的實(shí)驗(yàn)和經(jīng)驗(yàn)證明，乙酸酐和三乙醇胺液的處理并不能起到減低背景的目的，不能改善ISHH的信/噪比例。

3．減低背景染色。和免疫細(xì)胞化學(xué)染色一樣ISHH實(shí)驗(yàn)程序中，如何減低背景染色是一個(gè)重要的問(wèn)題。ISHH中背景染色的形成是諸多因素構(gòu)成的。雜交后（Posthybridization）的酶處理和雜交后的洗滌均有助于減低背景染色。預(yù)雜交（Prehybridization）是減低背景染色的一種有效手段。預(yù)雜交液和雜交液的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖（Dextransulphate）。將組織切片浸入預(yù)雜交液中可達(dá)到封閉非特異性雜交點(diǎn)的目的，從而減低背景染色。有的實(shí)驗(yàn)室在雜交后洗滌中采用低濃度的RNA酶溶液（20μg/ml）洗滌一次，以減低殘留的和內(nèi)源性的RNA酶，減低背景染色。

4．防止RNA酶的污染。由于在手指皮膚及實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，為防止其污染影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在整個(gè)雜交前處理過(guò)程都需戴消毒手套。所有實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿及鑷子都應(yīng)于實(shí)驗(yàn)前一日置高溫（240℃）烘烤以達(dá)到消除RNA酶的目的。要破壞RNA酶，其最低溫度必須在150℃左右。有條件的國(guó)外實(shí)驗(yàn)室在消毒的玻璃器皿外包以錫箔紙以利于標(biāo)記和防止取出時(shí)空氣污染。在無(wú)高溫消毒的烤箱時(shí)，亦可用國(guó)內(nèi)出產(chǎn)的衛(wèi)生蒸汽消毒鍋（山東新華醫(yī)療器材廠生產(chǎn)）。雜交前及雜交時(shí)所應(yīng)用的溶液均需經(jīng)高壓消毒處理。

核酸雜交_原位雜交 -雜交（Hybridisation）

在ISHH，整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期是比較長(zhǎng)的，實(shí)驗(yàn)程序也比較繁雜，而雜交在ISHH整個(gè)實(shí)驗(yàn)中可被認(rèn)為是“短兵相接”的一步。雜交前的一切準(zhǔn)備工作如增加組織通透性都是為了在雜交這一步驟中核酸探針能進(jìn)入細(xì)胞或組織與其內(nèi)的靶核苷酸相結(jié)合。因此，雜交是ISHH中關(guān)鍵的而且是最重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。

雜交是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片。國(guó)內(nèi)向正華等采用無(wú)菌的蠟?zāi)ご婀杌纳w玻片也可獲得滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。加蓋片的目的是防止孵育過(guò)程中的高溫（50℃左右）導(dǎo)致雜交液的蒸發(fā)。因此，也有為穩(wěn)妥起見(jiàn)，在蓋玻片周圍加液體石蠟封固的，但作者認(rèn)為這并不十分必要，因封固的石蠟在高溫下融解反易導(dǎo)致雜交液的污染，必要時(shí)可加橡皮泥封固蓋片四周。硅化的蓋玻片的優(yōu)點(diǎn)是清潔無(wú)雜質(zhì)，光滑不會(huì)產(chǎn)生氣泡和影響組織切片與雜交液的接觸，蓋玻片自身有一定重量能與有限的雜交液吸附達(dá)到覆蓋和防止蒸發(fā)的作用。在孵育時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，為保證雜交所需的濕潤(rùn)環(huán)境，可將復(fù)有硅化蓋玻片進(jìn)行雜交的載片放在盛有少量5×SSC或2×SSC（standardsalinecitrate,SSC）溶液的硬塑料盒（要能防止高溫破壞）中進(jìn)行孵育。雜交液的成分和預(yù)雜交液基本相同，所不同的是加入了標(biāo)記的核酸探針和硫酸葡聚糖。

如前所述，雜交前的準(zhǔn)備只是為雜交的成功奠定基礎(chǔ)，要獲得滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在雜交這一實(shí)驗(yàn)過(guò)程中還須注意以下的環(huán)節(jié)。

①探針的濃度。很難事先確定每一種實(shí)驗(yàn)探針的濃度，但要掌握一個(gè)原則，即探針濃度必須給予該實(shí)驗(yàn)最大的信/噪比值。背景染色的高低也與探針濃度有關(guān)。根據(jù)國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)工作者的經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為最佳原則應(yīng)是應(yīng)用最低探針濃度以達(dá)到與靶核苷酸的最大飽和結(jié)合度為目的。這和我們?cè)诿庖呒?xì)胞化學(xué)試驗(yàn)中選擇抗血清的最佳工作濃度的原則一樣。探針濃度依其種類和實(shí)驗(yàn)需要略有不同，根據(jù)筆者的經(jīng)驗(yàn)及所查閱文獻(xiàn)，在原位雜交細(xì)胞化學(xué)中，探針濃度為0.5～5.0μg/ml（即0.5～5.0ng/μl）。

根據(jù)Heinz、Hofelt實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)，對(duì)放射性標(biāo)記的dsDNA或cRNA探針，其濃度在2～5ng/μl。Conlton認(rèn)為生物素標(biāo)記探針，其最佳濃度在0.5～5ng/μl。作者在英皇家研究生院Polak教授實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用于放射性標(biāo)記cRNA探針的濃度為0.5ng/μl，而在非放射性標(biāo)記（生物素或地高辛）cRNA探針濃度為2.5ng/μl，放射性標(biāo)記DNA探針濃度為1.0ng/μl。向正華等應(yīng)用地高辛標(biāo)記生長(zhǎng)抑素cRNA探針獲得滿意結(jié)果，其探針濃度為0.5ng/μl。必須強(qiáng)調(diào)的是，國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室都證明加雜交液的量要適當(dāng)，以10～20μl/每張切片為宜。雜交液過(guò)多不僅造成浪費(fèi)，而且液量過(guò)多常易致蓋玻片滑動(dòng)脫落，影響雜交效果，過(guò)量的雜交液含核酸探針濃度過(guò)高，反易導(dǎo)致高背景染色等不良后果。

②探針的長(zhǎng)度。一般應(yīng)用于ISHH探針的最佳長(zhǎng)度應(yīng)在50～100個(gè)堿基之間。探針短易進(jìn)入細(xì)胞，雜交率高，雜交時(shí)間短。據(jù)報(bào)告，長(zhǎng)500個(gè)堿基的探針，其雜交時(shí)間約需20h左右。200～500個(gè)堿基的探針仍可應(yīng)用，如超過(guò)500個(gè)堿基的探針則在雜交前最好用堿或水解酶進(jìn)行水解，使其變成短的片段，達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需求的堿基數(shù)。

③雜交的溫度和時(shí)間。雜交的溫度也是雜交成功與否的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。在第十八章概述中曾提到DNA或RNA需加熱或變性、解鏈后才能進(jìn)行雜交。能使50%的核苷酸變性解鏈所需的溫度，叫解鏈溫度或融解溫度（meltingtemperature,簡(jiǎn)稱Tm）。原位雜交中，多數(shù)DNA探針需要的Tm是90℃，而RNA則需要95℃。這種高溫對(duì)保存組織形態(tài)完整和保持組織切片粘附在載玻片上是不可能的。因此，在雜交的程序中常規(guī)的加入30%～50%甲酰胺（for－mamide）于雜交液中。McConaughy報(bào)告，反應(yīng)液中每增加1%的甲酰胺濃度，Tm值可降低0.72℃。因此，可用調(diào)節(jié)鹽濃度的辦法來(lái)調(diào)節(jié)Tm。Tm的計(jì)算公式在第十九章有介紹，由公式的列出也表明了它與鹽的濃度、探針的長(zhǎng)度、甲酰胺的百分比等諸多因素有關(guān)。

由于鹽和甲酰胺濃度的調(diào)節(jié)等因素，實(shí)際采用的原位雜交的溫度在Tm-25℃左右，即比Tm減低25℃，大約在30～60℃之間，根據(jù)探針的種類不同，溫度略有差異，RNA和cRNA探針一般在37～42℃左右，而DNA探針或細(xì)胞內(nèi)靶核苷酸為DNA的，則必須在80～95℃加熱使其變性，時(shí)間5～15min，（有作用報(bào)告在105℃微波爐加熱使之變性），然后在冰上擱置1min，使之迅速冷卻，以防復(fù)性，再置入盛有2×SSC的溫盒內(nèi)，在37～42℃孵育雜交過(guò)夜。雜交的時(shí)間如過(guò)短會(huì)造成雜交不完全，而過(guò)長(zhǎng)則會(huì)增加非特異性染色。從理論上講，核苷酸雜交的有效反應(yīng)時(shí)間在3h左右。Barns等（1987）報(bào)告用DNA探針雜交，其反應(yīng)完成時(shí)間為2～4h。但為穩(wěn)妥起見(jiàn)，一般將雜交反應(yīng)時(shí)間定為16～20h，或?yàn)楹?jiǎn)便起見(jiàn)雜交孵育過(guò)夜，從現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)告看無(wú)不良結(jié)果。當(dāng)然，雜交反應(yīng)的時(shí)間與核酸探針長(zhǎng)度與組織通透性有關(guān)，在確定雜交反應(yīng)時(shí)間應(yīng)予考慮，并經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)確定。有作者主張雜交反應(yīng)的孵育應(yīng)在黑暗環(huán)境中進(jìn)行，因?yàn)楣饩€會(huì)促進(jìn)甲酰胺的電離作用。

④雜交嚴(yán)格度（Hybridizationstringency）。雜交條件的嚴(yán)格度（stringency）表示通過(guò)雜交及沖洗條件的選擇對(duì)完全配對(duì)及不完全配對(duì)雜交體的鑒別程度。錯(cuò)配對(duì)(mismatch)雜交的穩(wěn)定性較完全配對(duì)雜交體差，因此，通過(guò)控制雜交溫度、鹽濃度等，可減弱非特異性雜交體的形成，提高雜交的特異性。所以，雜交的條件愈高，特異性愈強(qiáng)，但敏感性降低，反應(yīng)亦然。一般來(lái)說(shuō)，低嚴(yán)格度（lowstringency）雜交及沖洗條件在Tm-35℃至Tm

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