愛華網(wǎng)利用單晶體對 X射線的衍射效應(yīng)來測定晶體結(jié)構(gòu)的實驗方法。依照強(qiáng)度記錄方式的不同，可分為照相法和衍射儀法兩類。
x射線衍射_單晶X射線衍射 -單晶X射線衍射
x射線衍射_單晶X射線衍射 -正文
利用單晶體對 X射線的衍射效應(yīng)來測定晶體結(jié)構(gòu)的實驗方法。依照強(qiáng)度記錄方式的不同，可分為照相法和衍射儀法兩類(見彩圖)。單晶X射線衍射照相法使射線作用在膠片上，然后測量底片上衍射點的黑度來獲得衍射線的強(qiáng)度數(shù)據(jù)，根據(jù)實驗裝置和條件的差別，又分為多種方法。
勞厄照相法用連續(xù)波長的 X射線照射到靜止不動的單晶體上，通常采用平板底片，所攝得的衍射圖稱為勞厄圖。勞厄圖常用來測定晶體的對稱性和用于晶體的定向等。
轉(zhuǎn)動照相法單波長的 X射線垂直照射到不停地轉(zhuǎn)動著的單晶體上，底片卷成圓筒狀并使其軸線與晶體的轉(zhuǎn)軸重合。若轉(zhuǎn)軸與晶體的某一晶軸（假定是c軸）平行，則衍射線分布在如圖1a
所示的一系列圓錐面上，衍射圖展平后如圖1b所示，圖中衍射點排列成一系列平行的層線。利用轉(zhuǎn)動圖中的層線間距可算出晶格參數(shù)（見點陣），若晶體的c軸與轉(zhuǎn)動軸一致，則c軸長可由下式求得：式中λ為X射線的波長；r為圓筒形底片的半徑；yn為第n層層線和零層線的距離。對于結(jié)構(gòu)簡單的晶體,轉(zhuǎn)動法可用于測定其晶體結(jié)構(gòu)；但對于較復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)動法就有困難，這是因為同一層線的衍射點分布密集，不利于衍射點的指標(biāo)化和強(qiáng)度測量。
回擺照相法實驗條件和裝置與轉(zhuǎn)動法基本一樣，差別在于照相過程中，晶體只在選定的角度范圍內(nèi)來回擺動。這樣可以避免同一層線上衍射點的重疊。但要攝取多套回擺圖，才能收集完整的衍射數(shù)據(jù)。回擺照相法若配上計算機(jī)，自動測量衍射點強(qiáng)度和指標(biāo)化，則有相當(dāng)?shù)膬?yōu)越性。目前廣泛用于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析，與四圓衍射儀比較，可節(jié)省衍射實驗的時間。
韋森堡照相法同一層線的衍射點是由不同晶面在晶體轉(zhuǎn)動的不同時刻反射得到的，若在晶體轉(zhuǎn)動時，讓帶動晶體擺動的馬達(dá)通過渦輪渦桿同時使底片圓筒左右來回擺動，就可將原在同一層線的衍射點分開，這類方法稱為運(yùn)動底片法。韋森堡照相法是運(yùn)動底片法的一種，其裝置如圖2所示。晶體的轉(zhuǎn)軸和感光膠片圓筒均水平安放,在晶體與底片之間有一個層線屏,以便將其他層的衍射線遮住，只讓某一層線的衍射線射到底片上，這類衍射圖如圖3所示。
單晶X射線衍射
單晶X射線衍射韋森堡圖既可用來確定晶體的微觀對稱性和晶格參數(shù)，又可較方便地進(jìn)行衍射點的指標(biāo)化和測量強(qiáng)度，因而在四圓衍射儀被廣泛使用之前，它是測定晶體結(jié)構(gòu)的重要方法之一。
單晶衍射儀法此法用射線計數(shù)儀直接記錄射線的強(qiáng)度。單晶衍射儀有線性衍射儀、四圓衍射儀和韋森堡衍射儀等,其中以四圓衍射儀(圖4)，(見彩圖)最為通用。所謂四圓是指晶體和計數(shù)器藉以調(diào)節(jié)方位的四個圓，分別稱為φ圓、χ圓、w圓和2θ圓。φ圓是安裝晶體的測角頭轉(zhuǎn)動的圓；χ圓是支撐測角頭的垂直圓,測角頭可在此圓上運(yùn)動；w圓是使χ圓繞垂直軸轉(zhuǎn)動的圓，2θ圓與w圓共軸，計數(shù)器繞著這個軸轉(zhuǎn)動。這四個圓中,w圓、φ圓和χ圓用于調(diào)節(jié)晶體的取向，使某一指定的晶面滿足衍射條件，同時調(diào)節(jié)2θ圓,使衍射線進(jìn)入計數(shù)器中。通常,四圓衍射儀配用電子計算機(jī)自動控制和記錄，可以精確測定晶格參數(shù)，并將衍射點的強(qiáng)度數(shù)據(jù)依次自動收集,簡化了實驗過程,而且大大提高了數(shù)據(jù)的精確度。因此，它已成為當(dāng)前晶體結(jié)構(gòu)分析中強(qiáng)有力的工具。
x射線衍射_單晶X射線衍射 -晶體衍射的基本公式
由于晶體中原子是周期排列的，其周期性可用點陣表示。而一個三維點陣可簡單地用一個由八個相鄰點構(gòu)成的平行六面體（稱晶胞）在三維方向重復(fù)得到。一個晶胞形狀由它的三個邊（a,b,c）及它們間的夾角（γ，α，β）所規(guī)定，這六個參數(shù)稱點陣參數(shù)或晶胞參數(shù),見圖1。這樣一個三維點陣也可以看成是許多相同的平面點陣平行等距排列而成的，這樣一族平面點陣稱為一個平面點陣族，常用符號HKL（HKL為整數(shù)）來表示。一個三維空間點陣劃分為平面點陣族的方式是很多的，其平面點陣的構(gòu)造和面間距d可以是不同的。晶體結(jié)構(gòu)的周期性就可以由這一組dHKL來表示。
一個小晶體衍射X射線，其衍射方向是與晶體的周期性（d）有關(guān)的。一個衍射總可找到一個晶面族HKL，使它與入射線在此面族上符合反射關(guān)系，就以此面族的符號HKL作為此衍射之指數(shù)。其間關(guān)系用布拉格方程（式1）來表示。
2dHKLsinθHKL=nλ（1）
式中,θHKL為入射線或反射線與晶面族之間的夾角，λ為入射X射線波長，n為反射級數(shù)。
衍射線的強(qiáng)度是與被重復(fù)排列的原子團(tuán)的結(jié)構(gòu)，也即和原子在晶胞中的分布裝況（坐標(biāo)）有關(guān)，其間的關(guān)系由方程式（2）表示
式中,E稱為累積能量，I0為入射線強(qiáng)度，e,m為電子的電荷與質(zhì)量，c為光速，λ為X射線波長，Vu為晶胞體積，稱洛侖茲偏振（LP）因子，|F|為結(jié)構(gòu)振幅，e-2MT為溫度因子，A為吸收因子，V為小單晶體的體積，ω為樣品的轉(zhuǎn)速，其中結(jié)構(gòu)因子=|FHKL|eiαHKL（3）
式中,fj,xj,yj,zj分別為第j個原子的原子散射因子及它在晶胞中的分?jǐn)?shù)坐標(biāo)（以晶胞邊長為1）。n為晶胞中的原子數(shù)。αHKL為HKL衍射的相角。從此式可知衍射線強(qiáng)度是與各原子在晶胞中的位置（即結(jié)構(gòu)）有關(guān)的，故反過來可從衍射線強(qiáng)度的分析解出晶胞中各原子的位置，即晶體結(jié)構(gòu)。其方法是（4）
通過晶胞中的電子密度ρ（x,y,z）的計算。
故若知各衍射的FHKL,就可按（4）式計算晶胞的三維電子密度圖。原子所在處電子密度應(yīng)該很高，故依此可定出原子在晶胞中位置，得出晶體結(jié)構(gòu)。但是從衍射強(qiáng)度獲得的是結(jié)構(gòu)振幅|F|，|F|與F之間的關(guān)系見式（3）。如何求得各HKL衍射的相角αHKL就成為X射線單晶衍射解晶體結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵。
x射線衍射_單晶X射線衍射 -可能的發(fā)展方向
數(shù)據(jù)的積累
從前述的應(yīng)用已經(jīng)看出，晶體結(jié)構(gòu)的測定及結(jié)構(gòu)與性能關(guān)系的研究,是今后走上人類按需設(shè)計新材料的基礎(chǔ)。今日雖已測了許多晶體的結(jié)構(gòu),但還有許多未能測定,而且還不斷有新化合物，新晶體出現(xiàn),因此不斷的測定他們的結(jié)構(gòu),加以總結(jié)分析是十分必要的。當(dāng)今已有多個晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫，如：（1）劍橋結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（CSD）。包括各種有機(jī)，有機(jī)金屬化合物及配合物的晶體學(xué)數(shù)據(jù)。（2）無機(jī)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（ICSD）。（3）金屬結(jié)晶學(xué)數(shù)據(jù)庫（CRXSTMET）。(4）蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB）。（5）晶體學(xué)數(shù)據(jù)（CD）。（6）粉末衍射卡片（PDF）。(7）有序無序結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（OD）等。
各種生物大分子結(jié)構(gòu)的測定
2001年2月12日，人類基因組框架圖發(fā)表。接下來的任務(wù)是要把各基因的結(jié)構(gòu)和功能搞清楚，有大量的基因結(jié)構(gòu)需要測定。世界上已經(jīng)成立了結(jié)構(gòu)基因組的國際合作組織，分配人類基因結(jié)構(gòu)的測定任務(wù)。除了人類基因以外，還有水稻基因組，各種病毒等范圍更廣的生物大分子結(jié)構(gòu)需測定。生物大分子的數(shù)量將會遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過各種無機(jī)物，有機(jī)物分子的總量。生物大分子結(jié)構(gòu)測定將是今后晶體結(jié)構(gòu)測定的主要任務(wù)。
結(jié)構(gòu)與性能關(guān)系的研究與應(yīng)用
按照已知的結(jié)構(gòu)和性能的關(guān)系設(shè)計制造需要的新材料是進(jìn)行大量結(jié)構(gòu)測定的目的。如何總結(jié)大量已測結(jié)構(gòu)的規(guī)律并與其性能、功能相聯(lián)系是今后的任務(wù)之一。特別是生物結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。進(jìn)一步如何利用這種關(guān)系設(shè)計制造人類需要的材料，藥物等,更是永不完結(jié)的任務(wù)。
解生物大分子結(jié)構(gòu)方法的發(fā)展
目前雖已有各種方法用來解決相角的問題，但要置換許多同晶化合物還是頗費(fèi)時和頗昂貴的，如果能如小分子那樣用直接法來解決相角問題，將會方便許多。我國科學(xué)家范海福院士是研究直接法的世界權(quán)威人物，正在進(jìn)行這方面的研究。
單晶體結(jié)構(gòu)分析實驗方法的發(fā)展
目前的實驗室單晶體結(jié)構(gòu)分析方法對于測定小分子的單晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)是相當(dāng)完美了,但對于巨大的生物大分子就顯得軟弱無力，主要是光源強(qiáng)度不夠，光的平行性不良，波長又不好調(diào)。目前主要要依靠同步輻射作為X射線源。我國二個同步輻射光源之一的位于合肥的國家同步輻射實驗室（NSRL）今年上半年已勝利完成用于生物大分子結(jié)構(gòu)測定的光束線與實驗站的建設(shè),并已收集到尖吻蝮蛇蛇毒磷脂酸A2，神經(jīng)毒等多種生物大分子的衍射數(shù)據(jù)，并解出了結(jié)構(gòu)。另一個北京同步輻射裝置(BSRF)的生物平臺使用的是聚焦光束。也已于2002年12月4日投入試運(yùn)轉(zhuǎn)，在樣品冷凍條件下成功地收集了18套結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，情況良好。數(shù)據(jù)分析正在進(jìn)行中。
同步輻射
是一種大科學(xué)裝置，設(shè)備大投資高，一般都需要政府投資，不是一般實驗室所能具備的，需要申請立項才能使用。因此，如果能發(fā)展出高強(qiáng)度的實驗室光源和極高靈敏度的探測器，使在一般實驗室中也能測定生物大分子結(jié)構(gòu)，則絕對是有益的。
有許多生物反應(yīng)的速度是相當(dāng)快的,如血紅蛋白與一氧化碳的結(jié)合，速度在納秒級（10-9sec），要對這種反應(yīng)進(jìn)行動力學(xué)研究，既要有高強(qiáng)度脈沖光源,又要有快速切換的探測器以連續(xù)跟蹤反應(yīng)?，F(xiàn)在已有了強(qiáng)脈沖光源，但探測器的切換速度卻慢太多，需要作長時間的更大的努力。
x射線衍射_單晶X射線衍射 -編輯本段衍射數(shù)據(jù)的處理
一般步驟
1．選擇大小適度，晶質(zhì)良好的單晶體作試樣,收集衍射數(shù)據(jù)。
2．指標(biāo)化衍射圖，求出晶胞常數(shù)，依據(jù)全部衍射線的衍射指標(biāo)，總結(jié)出消光規(guī)律，推斷晶體所屬的空間群。
3．將測得的衍射強(qiáng)度作吸收校正，LP校正等各種處理以得出結(jié)構(gòu)振幅|F|。
4．相角和初結(jié)構(gòu)的推測。常用推測相角的方法有派特遜函數(shù)法及直接法。
派特遜函數(shù)的定義
從派特遜圖上可以比較容易地得到晶體中所含重原子的位置坐標(biāo)，可依此計算各衍射的相角αHKL，將此αHKL去與實驗測得的結(jié)構(gòu)振幅|FHKL|結(jié)合生成FHKL，可據(jù)此計算電子密度圖，可以定出更多原子的原子位置及修正已有的原子位置。再利用這些數(shù)據(jù)重新計算αHKL、FHKL及ρ（x,y,z），如此反復(fù)疊代多次推出完整的晶體結(jié)構(gòu)。
直接法是利用結(jié)構(gòu)振幅間的某些統(tǒng)計關(guān)系求出衍射相角的方法。在求出某些衍射的相角αHKL以后，把他們?nèi)ヅc實驗測得的|FHKL|配合生成FHKL，進(jìn)而計算ρ（x,y,z），從中獲得部分原子的位置，從此修正和擴(kuò)充已有的相角，如派特遜那樣反復(fù)疊代以得出完整的結(jié)構(gòu)。
結(jié)構(gòu)的精修
由派特遜函數(shù)或直接法推出的結(jié)構(gòu)是較粗糙和可能不完整的，故需要對此初始結(jié)構(gòu)進(jìn)行完善和精修。常用的完善結(jié)構(gòu)的方法稱為差值電子密度圖，常用的精修結(jié)構(gòu)參數(shù)的方法是最小二乘方法，經(jīng)過多次反復(fù)，最后可得精確的結(jié)構(gòu)。同時需計算各原子的各向同性或各向異性溫度因子及位置占有率等因子。最終所得結(jié)果的優(yōu)劣常用吻合因子R來衡量式中，w為權(quán)重因子，下標(biāo)o，c表示實測值，計算值。
結(jié)構(gòu)的表達(dá)
在獲得精確的原子位置以后，要把結(jié)構(gòu)完美的表達(dá)出來，這包括鍵長鍵角的計算，繪出分子結(jié)構(gòu)圖和晶胞圖，并從其結(jié)構(gòu)特點探討某些可能的性能。
生物大分子結(jié)構(gòu)的測定
生物大分子結(jié)構(gòu)的測定，從原理上講與小分子（無機(jī)物，有機(jī)物，配合物等）無異，但由于分子大也帶來一定的特殊性，需要有一些不同于小分子的方法。
大分子的特點是分子量大，原子多，但原子序數(shù)小,多數(shù)是C，H，O，N等輕元素，故散射能力低，不易收集到高角的衍射點，這會使電子密度圖的分辨率降低。還因他晶胞大，所含原子數(shù)目多，需確定的結(jié)構(gòu)參數(shù)就多，這與分辨率低有矛盾。另外，大分子晶體在X射線的照射下易于損壞，如何縮短實驗時間也成為一個重要問題。
大分子由于分子量大，要求使用較大體積的單晶體，如對于分子量為5000的蛋白質(zhì)分子，就要有大于0.3mm3的單晶體。但因其分子大，結(jié)晶就困難，而且很易結(jié)晶成孿晶，這不合用。得到合用的晶體是整個大分子結(jié)構(gòu)測定中關(guān)鍵的一步，常說有了良好的晶體，結(jié)構(gòu)測定一半的問題已解決了。
一般用回擺法收集衍射數(shù)據(jù)，用IP或CCD作探測器，可以在幾個小時內(nèi)完成數(shù)據(jù)收集工作。
關(guān)于相角問題，在解小分子結(jié)構(gòu)中目前最常使用的直接法還不能用于大分子，而派特遜法，由于大分子缺少重原子也無法使用。目前是用基于派特遜法的幾個方法來解決相角問題的。
分子取代法
有時,幾個不同的生物大分子是由相同的結(jié)構(gòu)單位以不同方式連接而成的;同一種生物大分子如在不同的條件中結(jié)晶,有可能得到不同的結(jié)晶,是為多結(jié)晶現(xiàn)象;還有些生物分子,他們是由共同的分子祖先進(jìn)化而得,因此其中有相當(dāng)部分是相同的。對于這些類的生物分子,他們的派特遜圖常有很大的相似性。因此，在求解某生物大分子結(jié)構(gòu)時,如能找到與他有類似的結(jié)構(gòu),且結(jié)構(gòu)已測定的生物大分子結(jié)構(gòu)時,則可按最大重疊原理找出待測物和已知物的派特遜圖之間的關(guān)系,從而得出未知物衍射的位相,進(jìn)而解出結(jié)構(gòu)。若已知物和待測物是同晶化合物,則可利用差值電子密度圖來解出結(jié)構(gòu),更為簡單。
若在已知結(jié)構(gòu)的大分子結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中找不到與待測物有類似結(jié)構(gòu)的分子結(jié)構(gòu)時,就不能使用此法,要使用以后的方法。
重原子同晶置換法
這種方法是設(shè)法把對X射線散射能力大的重金屬原子，如Hg，Pb，Se等引入生物分子中，作為標(biāo)識原子。這種置換入重原子的大分子應(yīng)與無重原子時的原晶體有相同的晶胞參數(shù)和空間群，且絕大多數(shù)原子的位置相同，故稱同晶置換。從這些含重原子晶體的衍射數(shù)據(jù)，利用基于派特遜法的方法可解出重原子的位置，據(jù)此算出其結(jié)構(gòu)因子和相角，進(jìn)而利用相角關(guān)系計算出沒有重原子的原晶體的相角，解出結(jié)構(gòu)。
經(jīng)常使用不只一種重原子進(jìn)行置換，以得幾種同晶置換衍生物,稱多對同晶置換法。同晶置換，衍生物越多,可正確定出的相角也越多。
反常散射法
晶體衍射中有一條弗里德耳定律,就是說不論晶體中是否存在對稱中心,在晶體衍射中總存在著對稱中心,也即有FHKL=FHKL。但是當(dāng)使用的X射線波長與待測樣品中某一元素的吸收邊靠近時,就不遵從上述定律,也即FHKL≠FHKL。這是由電子的反常散射造成的,利用這一現(xiàn)象可以解決待測物的相角問題。一般,這一方法常與重原子同晶置換法結(jié)合使用。
在收得同晶置換物的衍射數(shù)據(jù)后,改變?nèi)肷渚€波長至靠近重原子的吸收邊處，再次收集數(shù)據(jù)，這套數(shù)據(jù)是存在反常散射的,可利用這兩套數(shù)據(jù)來求位相。有如多同晶置換法,如采用幾個不同波長的X射線,對所含不同元素收集幾套反常散射數(shù)據(jù),則可得更正確、更完整的相位信息,是為多波長反常衍射法(MAD),是目前解分子生物大分子的重要方法。實驗室X射線光源不易使用這一方法,因要改變X射線波長是很困難的,而對于同步X射線光源,改變波長是相當(dāng)方便的,因此常被使用。
愛華網(wǎng)本文地址 » http://www.klfzs.com/a/8103220103/16187.html
