愛華網(wǎng)以核苷或單核苷酸為原料并且不依靠任何天然模板或引物，采用有機(jī)合成反應(yīng)或酶促合成反應(yīng)進(jìn)行的寡核苷酸或核酸大分子的合成。在核酸的理論研究和實際應(yīng)用上人工合成是一個重要的手段。1957～1965年H.G.科拉納等人設(shè)計并合成了由一種、兩種或3種脫氧核苷酸組成的重復(fù)順序的脫氧寡核苷酸片段，并以此為模板用DNA聚合酶和RNA聚合酶進(jìn)一步復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，得到了具有對應(yīng)的互補順序的長鏈人工信使核糖核酸(mRNA)，再用這種人工mRNA在無細(xì)胞體系中進(jìn)行蛋白質(zhì)合成。通過分析這樣得到的多肽產(chǎn)物的氨基酸順序和與模板中核苷酸順序的對應(yīng)關(guān)系破譯了遺傳密碼。
核酸_核酸的人工合成 -核酸的人工合成
核酸_核酸的人工合成 -正文
人工合成基因促進(jìn)了基因工程的發(fā)展。如1977年,坂倉等人首先合成了生長激素釋放抑制因子的基因，并使之在大腸桿菌中實現(xiàn)了表達(dá)，得到了在大腸桿菌中原來并不存在的活性肽（十四肽）。此后，一系列多肽和蛋白質(zhì)基因，如胰島素、干擾素和生長激素等的基因相繼被合成，并得到了很好的表達(dá)，使得這些原來只能從動物組織中得到的含量不多的蛋白質(zhì)能以細(xì)菌發(fā)酵的辦法大量生產(chǎn)。
1981年中國生化學(xué)家王德寶等完成了酵母丙氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸的全合成工作，這是第一個人工合成的具有全部生物活性的RNA分子。
核酸合成包括化學(xué)合成和酶促合成兩個方面。
化學(xué)合成以核苷或單核苷酸為原料，完全用有機(jī)化學(xué)方法來合成核酸。由于核苷酸是一個多官能團(tuán)的化合物，因此,在化學(xué)合成中,必須將不希望發(fā)生反應(yīng)的基團(tuán)保護(hù)起來。例如想將圖1 中甲、乙兩個3′-核苷酸連接起來生成3′-5′-磷酸二酯鍵,并且要符合甲在乙前的順序,如果不將某些基團(tuán)保護(hù)起來，勢必會發(fā)生許多不需要的副反應(yīng)干擾產(chǎn)物的生成。在這里,只希望核苷酸甲的3′位上的磷酸基團(tuán)與核苷酸乙的5′位上的羥基反應(yīng),因此甲的2′和5′-羥基,乙的2′-羥基和3′磷酸基團(tuán)都必須保護(hù)起來,以排除不必要的副反應(yīng)。又如圖2 所示由核苷酸甲和核苷乙合成二核苷一磷酸的反應(yīng)式中，R1、R2、R3和R4都是保護(hù)基,其作用是使核苷酸甲的3′磷酸基能專一的只同核苷乙的5′羥基反應(yīng)生成甲-乙順序的3′-5′-磷酸二酯鍵。此外，在核苷酸的堿基上如果有氨基（如胞嘧啶、腺嘌呤和鳥嘌呤的環(huán)外氨基）也必須加以保護(hù)。在DNA合成中,由于脫氧核苷的2′位上是氫而不是羥基,就不必保護(hù)。
核酸的人工合成
核酸的人工合成除了用圖2中的兩種原料外,也可以將核苷乙改為5′-核苷酸，并把2′和3′位上的羥基保護(hù)起來，同2′和5′羥基被保護(hù)的核苷甲上的3′羥基反應(yīng)（圖3）。
核酸的人工合成由于這兩個反應(yīng)是通過磷酸單酯和羥基縮合生成3′-5′磷酸二酯，故稱為磷酸二酯（合成）法。
在磷酸二酯法中，由于產(chǎn)物為磷酸二酯，磷酸上所剩下的OH基團(tuán)，雖然化學(xué)活性較小,但也能發(fā)生反應(yīng),因此,當(dāng)合成的寡核苷酸鏈逐漸增長時,由這個磷酸OH基團(tuán)所帶來的副反應(yīng)也愈益嚴(yán)重，使合成產(chǎn)率急劇下降。目前這個方法已基本上被淘汰，改進(jìn)的辦法之一是采用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基把磷酸上的OH基團(tuán)也保護(hù)起來，再進(jìn)行連接反應(yīng)。即如圖4 所表示的那樣，用甲核苷3′-磷酸二酯（用R5保護(hù)磷酸上的OH基團(tuán)）同乙核苷的5′-羥基反應(yīng)生成磷酸三酯型的產(chǎn)物，這個方法稱為磷酸三酯法。
核酸的人工合成另一個改進(jìn)的辦法是采用圖5 所示的路線，以保護(hù)的亞磷酰胺單體為原料，經(jīng)1-H-四氮唑活化后與羥基組分連接，先生成亞磷酸三酯，再氧化得到磷酸三酯，稱為亞磷酰胺法或亞磷酸三酯法。
核酸的人工合成在磷酸三酯法和亞磷酸三酯法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的固相合成法,其基本原理是將要合成的寡核苷酸鏈的3′末端核苷先固定在一個不溶性的高分子上面，然后再從此末端核苷開始，逐步接長，接長的鏈?zhǔn)冀K被固定在載體上，過量的未反應(yīng)物和分解產(chǎn)物則通過過濾或洗滌除去，每接長一個經(jīng)歷一次循環(huán)。當(dāng)整個鏈的增長達(dá)到所需要的長度后，再將寡核苷酸鏈從固相載體上切落下來并脫去保護(hù)基，經(jīng)過分離純化得到所需要的最后產(chǎn)物。
固相合成不僅可以縮短合成的時間,提高總產(chǎn)率,并且由于每一個縮合循環(huán)都經(jīng)過同樣的操作步驟，因此可以采用自動控制手段。目前已經(jīng)設(shè)計出多種型號的全自動或半自動的合成機(jī)器，其每一次的連接產(chǎn)率達(dá)到97～99％，最快的每輪循環(huán)不到10分鐘，最長的合成片段可到100核苷酸以上。
酶促合成通過酶促反應(yīng)可以把化學(xué)合成的小片段連接成為大片段，或是從已經(jīng)合成的單鏈制成雙鏈，它可以加快合成工作的進(jìn)展，使人工合成核酸大分子的目標(biāo)得以順利地實現(xiàn)。
大腸桿菌DNA連接酶和T4噬菌體DNA連接酶是兩種經(jīng)常使用的DNA連接酶。大腸桿菌的DNA連接酶要求兩個被連接片段的末端上有幾個互補的堿基（稱為粘性末端），否則就不能連接(圖6)。
核酸的人工合成T4DNA連接酶不但可以連接帶有粘性末端的DNA片段，也可以連接平頭的末端（圖7）。
核酸的人工合成已知有幾種酶可以用于 RNA合成。多核苷酸磷酸化酶能夠以2′位上保護(hù)的核苷二磷酸為底物,在一個三核苷二磷酸的引物片段上接長一個核苷酸，以得到的產(chǎn)物作引物,經(jīng)過同樣循環(huán),可以合成更長一些的RNA片段。利用核糖核酸酶N1、T1、U2和牛胰核糖核酸酶A等核酸水解酶的逆反應(yīng)，在適當(dāng)條件下,也可以合成某些RNA小片段。T4噬菌體感染大腸桿菌后產(chǎn)生的T4RNA連接酶,是RNA大分子合成中最重要的一個工具酶,它能催化帶有5′-磷酸的RNA片段（又稱供體）同另一個帶有3′-羥基的RNA片段（又稱受體）之間的單鏈連接反應(yīng)，不僅能夠合成RNA小片段，也能合成RNA大片段。
中國科學(xué)工作者在人工合成轉(zhuǎn)移核糖核酸的工作中曾經(jīng)對RNA的酶促合成反應(yīng)，特別是對有關(guān)T4RNA連接酶催化合成RNA的最適反應(yīng)條件進(jìn)行過深入的研究,他們在化學(xué)合成或化學(xué)加酶促合成的 RNA小片段的基礎(chǔ)上利用T4RNA連接酶先合成得到6個較大的片段，然后再進(jìn)一步連接成兩個半分子并最后實現(xiàn)酵母丙氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸的全合成。圖8是酵母丙氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸的結(jié)構(gòu)和 6個大片段及兩個半分子的合成分段位置。
核酸的人工合成參考書目
王德寶、祁國榮：《核酸結(jié)構(gòu)、功能與合成》、科學(xué)出版社，北京，1986。
王德寶等：酵母丙氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸的人工全合成，《中國科學(xué)（B輯）》，1983/5，北京。
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