愛華網(wǎng)在鑒定疾病狀態(tài)以及治療狀態(tài)的反映這些方面，蛋白生物標(biāo)記物（protein biomarker）得到廣泛的應(yīng)用。但是，有效的蛋白標(biāo)識(shí)物的數(shù)目是有限的，盡管在過去十年付出了很大的努力去尋找顯著的生物標(biāo)識(shí)物（novel biomarker）,可是成功率還是非常低。生物標(biāo)識(shí)物的發(fā)現(xiàn)研究一般用到血清和血漿，這是因?yàn)檫@些非常容易獲得。而且，血液流動(dòng)于所有的組織器官，能獲得這些組織滲漏出來的蛋白，這些蛋白能標(biāo)識(shí)到疾病導(dǎo)致的傷害。但是，發(fā)現(xiàn)這些低豐度蛋白標(biāo)識(shí)物（low-abundance biomarker proteins）的過程常常會(huì)受到高豐度蛋白（high-abundance proteins 簡(jiǎn)稱HAPs）的妨礙。血清血漿中蛋白的濃度橫跨十一個(gè)數(shù)量級(jí)（span a concentration range of 11 orders ofmagnitude），其中里面20種最多的蛋白就占了總蛋白含量的97～99%。在mg/ml含量的蛋白雜質(zhì)背景下去檢測(cè)pg/ml的目標(biāo)標(biāo)識(shí)物是一個(gè)可怕的（formidable）分析挑戰(zhàn)。
簡(jiǎn)易的凈化（simplify）血清和血漿中的蛋白組方法主要是針對(duì)不同種類HAPs（specific members of the class of HAPs）進(jìn)行。這是因?yàn)樗鼈冸m然數(shù)目不多，但是重量占了大多數(shù)。 清蛋白(Albumin)，就占了蛋白組50～70%的重量，它們能被假親和（pseudo-affinity）比如Cibacron Blue chromatography*（reactive blue agarose是一種機(jī)制不很明確的親和填料，它與很多蛋白的結(jié)合如人血清白蛋白，糖蛋白等都是特異性的（針對(duì)于它不結(jié)合的蛋白而言），有是非特異性的（能夠跟很多亂七八糟的蛋白結(jié)合），所以說他是pseudo-affinitychromatographic 。我想這東西應(yīng)該與paraoxonase有親和）除去。Immunoglobulin G，占蛋白組中8～26%，能通過親和色譜被蛋白A和蛋白G柱子除去。但是不幸的是，除去以上一種或兩種蛋白時(shí)，仍然會(huì)出現(xiàn)難以控制的分析問題。免疫親和色譜被認(rèn)為是出去HAPs的一個(gè)可行的方法，現(xiàn)在免疫去除技術(shù)已有幾種產(chǎn)品商業(yè)化。這在之前“Sample Prep Perspective”一文中已有陳述，這里就簡(jiǎn)單描述一下。這篇文章的重點(diǎn)主要是集中在在之前評(píng)論后出現(xiàn)的產(chǎn)品。
一步分離的產(chǎn)品：
在過去三年，Agilent Technologies、Sigma Aldrich、Genway Biotech(TNND，全是美國(guó)公司，兩個(gè)加州，一個(gè)密蘇里州)針對(duì)人體血清和血漿中HAP的去除開發(fā)了許多免疫物質(zhì)。這些東西都是為了達(dá)到一步去除的，根據(jù)不同的樣品，能去除最多20中HAPs。這些產(chǎn)品對(duì)其他哺乳動(dòng)物（mammals）的血清、血漿一樣起效(show cross-reactivity)。
免疫凈化聯(lián)用系統(tǒng)（multiple affinity removal system，簡(jiǎn)稱MARS）：
Agilent Technologies 公司是將聯(lián)用技術(shù)第一個(gè)商業(yè)化的。它是在聚合物(polymeric)的擔(dān)體上結(jié)合了六種人體血清HAPs（serum albumin ,IgG,α-1-antitrypsin,haptoglobin,and IgA）的抗體?？贵w通過Fc區(qū)域與聚合物結(jié)合，這樣的連接能使蛋白與親和鍵合點(diǎn)（provides easy access of protein to theaffinity binding sites）容易結(jié)合。MARS產(chǎn)品有色譜柱填料、萃取柱填料兩種。據(jù)報(bào)道去除效率大于99%，腫瘤標(biāo)記物(spiked tumor markers)的回收率為78%。在之后的產(chǎn)品線有加上了Human-7柱，它能去除之前的六種HAPS還加上纖維蛋白原(fibrinogen)，Mouse-3柱，專為了去除murine albumin,immunoglobulin,transferring
ProteoPrep20 血漿免疫凈化試劑盒(ProteoPrep20 plasma immunodepletion kit)
這套技術(shù)是來自Sigma-Aldrich的，它有20種人體血漿HAPS的抗體組成?？贵w包括多克隆的IgGs，抗體由專有的單鏈聯(lián)接鏈接到擔(dān)體（support）上。這產(chǎn)品也是有色譜柱和萃取柱兩種形式。它能一次性去除98%重量的血漿蛋白，當(dāng)進(jìn)行二次去除時(shí)就大于99%。對(duì)20種蛋白的平均去除率為99.3%。
Seppro基于Ig-Y的免疫凈化產(chǎn)品（Seppro IgY-based immunodepletionproduct）
Genway Biotech 開發(fā)了一系列基于avian yolk(IgY)抗體的免疫產(chǎn)品。這些抗體主要通過在母雞中注入純化的人體HAP作為抗原得出的。IgY抗體產(chǎn)生于蛋黃中，生產(chǎn)中就通過鍵合這些蛋白抗體的親和色譜柱來進(jìn)行純化。之后這些抗體就連接到交聯(lián)聚合物組成的擔(dān)體上。每種抗HAP的IgY組合后就是免疫凈化試劑，根據(jù)組合的不同，它能去除6，12或者14種HAPs。這產(chǎn)品能以散裝、萃取柱、色譜柱的形式銷售。對(duì)比基于IgG的產(chǎn)品，IgY能提供更多的優(yōu)勢(shì)：首先，IgY抗體對(duì)HAPs有更好的親和性；其次，IgY抗體的Fc區(qū)域不會(huì)對(duì)人體蛋白進(jìn)行吸收。而這是與IgG抗體的Fc區(qū)域不同，他會(huì)與其他多余的蛋白結(jié)合。由于沒有交聯(lián)反應(yīng)使得IgY更具專一性；還有的就是，目標(biāo)蛋白能容易地通過IgYs，使得它的產(chǎn)品可以反復(fù)使用（multiple times）；最后，由于鳥類與哺乳類之間進(jìn)化的差距，IgYs比IgGs具有能廣的適用性。這使得IgYs能用于其他哺乳類蛋白組比如老鼠、山羊。
ProteoSpinabundant serum protein depletion kit：
The Norgen Biotek Corp.（加拿大的公司）沒有采用親和技術(shù)，他們采用離子交換技術(shù)對(duì)HAP進(jìn)行凈化。
多步免疫凈化產(chǎn)品（Multistep Immunodepletion Products）：
除了高豐度的蛋白（HAPs）,中等豐度的蛋白（MAPs）也會(huì)對(duì)低豐度的蛋白（LAPs）發(fā)生干擾。為此，Genway 通過把其IgY-12和IgY-14 HAP凈化系統(tǒng)再結(jié)合上一支免疫凈化柱子去除MAPs。這根柱子就叫SuperMix。
通過與Agilent 7- antibody和Genway IgY-14這些一步凈化的產(chǎn)品比較，兩步凈化程序有更好的凈化效率。
肽免疫親和的蛋白質(zhì)凈化（Protein Depletion Using PeptideAffinity）：
基于抗體產(chǎn)品免疫凈化有兩個(gè)不足之處：首先，洗脫的過程樣品會(huì)被稀釋；其次，當(dāng)需要得到更多的其他目標(biāo)蛋白組時(shí)，需要擴(kuò)展免疫凈化技術(shù)。解決方法之一就是利用結(jié)合了六肽（hexapeptides）色譜分離技術(shù)。這技術(shù)由加州的Bio-Rad 實(shí)驗(yàn)室開發(fā)，它在有效凈化HAPs的同時(shí)克服了免疫凈化的缺點(diǎn)。產(chǎn)品以萃取柱為主，對(duì)比基于抗體免疫的產(chǎn)品，100ul的填料體積能容納超過1ml的樣品，過量的HAPs直接通過，沒有保留。樣品上樣、淋洗后用小于300ul的洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫。結(jié)果就是HAPs的去除和至少三倍濃度提高的LAPs，回收率為99.6%，去除率為96%。
結(jié)論：
當(dāng)前已有許多的蛋白凈化產(chǎn)品成功商業(yè)化，它們能大大簡(jiǎn)化蛋白標(biāo)識(shí)物的凈化任務(wù)。它們的大部分都是一步的基于抗體的免疫凈化產(chǎn)品，能去除最多14種人體血清血漿中的高豐度蛋白。近來多步免疫凈化產(chǎn)品還有肽親和技術(shù)都有很好的潛力，它們都能很好地與擁有顯著蛋白標(biāo)識(shí)物的蛋白組結(jié)合（reachingthat segment of the proteome where noval biomarkers are hoped toreside）。
