愛華網(wǎng)反義寡核苷酸
（antisenseoligonucleotide）
反義寡核苷酸（antisenseoligonucleotide）通常指進(jìn)行了某些化學(xué)修飾的短鏈核酸（約15-25個核苷酸組成），它的堿基順序排列與特定的靶標(biāo)RNA序列互補(bǔ)，進(jìn)入細(xì)胞后可按照Watson-Crick堿基互補(bǔ)配對的原則與靶標(biāo)序列形成雙鏈結(jié)構(gòu)。反義寡核苷酸與靶標(biāo)基因的RNA結(jié)合后可通過各種不同的機(jī)制影響靶標(biāo)基因的表達(dá)。
反義寡核苷酸可用于基因沉默，所以是一種研究基因功能的重要工具。大多數(shù)藥物屬于靶標(biāo)基因（或疾病基因）的抑制劑，因此反義寡核苷酸模擬了藥物的作用，這功能丟失（LOF)的研究方法比傳統(tǒng)的功能獲得（GOF)方法更具優(yōu)勢。同時，那些在靶標(biāo)實驗中證明有效的反義寡核苷酸本身還可以被進(jìn)一步開發(fā)成為反義寡核苷酸藥物。
反義寡核苷酸——新型抗菌藥物的曙光
來源:醫(yī)學(xué)與哲學(xué)日期: 2006-01-12
1反義RNA的發(fā)現(xiàn)和研究歷程
天然反義RNA是一類分子質(zhì)量較小的多聚寡核苷酸，它們與生物體雙鏈DNA的正義鏈或mRNA的一段序列互補(bǔ)。最早是由E.Coli體內(nèi)質(zhì)粒復(fù)制的調(diào)控而發(fā)現(xiàn)的。原核生物中反義RNA抑制基因表達(dá)的方式有三種：(1)DNA復(fù)制水平:反義RNA與引物前體結(jié)合，阻止正常引物的產(chǎn)生，使DNA復(fù)制不能進(jìn)行。(2)轉(zhuǎn)錄水平：反義RNA與mRNA5′端結(jié)合，形成類似于轉(zhuǎn)錄終止信號的Ⅱ級結(jié)構(gòu)；(3)翻譯水平：又分為兩種方式，即反義RNA與mRNASD序列和/或編碼起始區(qū)結(jié)合，直接抑制翻譯或與mRNA非編碼區(qū)結(jié)合，使mRNA分子構(gòu)象發(fā)生改變而不能與核糖體結(jié)合，間接抑制翻譯。反義RNA可由人工合成及反以表達(dá)載體兩種方式得到。后者是利用基因重組技術(shù)，在適當(dāng)?shù)膯幼雍娃D(zhuǎn)錄終止子間反向插入一段靶基因，所得到的、反義表達(dá)的RNA可抑制同源基因的表達(dá)，效果穩(wěn)定、持久。人工合成的反義寡核苷酸包括反義RNA和反義DNA,通常由15～20個核苷酸組成，為防止細(xì)胞內(nèi)核酸酶的分解作用，常將其進(jìn)行化學(xué)修飾。將他們運送到靶細(xì)胞，只產(chǎn)生短效應(yīng)，不會留下長效的遺傳效應(yīng)，這對于前期研究尚未探明其副作用的前提下，有較好的安全性；其用量及作用的靶序列可以人為控制，原則上不會干擾其它基因結(jié)構(gòu)和它們自身正常的調(diào)控方式；尤其是反義寡核苷酸不會產(chǎn)生耐藥性，還可采用多點反義處理增強(qiáng)抑制效果。反義RNA的基因沉默功能不僅可以用來研究未知基因功能，而且可用于多種疾病的治療。自Zammeenik等首次報道以反義寡核苷酸抑制勞氏肉瘤病毒復(fù)制后，反義寡核苷酸便迅速應(yīng)用于腫瘤、病毒感染、寄生蟲病的研究。Liusong-kai等分別利用反義RNA和siRNA抑制HIV-1復(fù)制過程中所需細(xì)胞蛋白CyPA的合成，結(jié)果均明顯抑制了HIV-1在人T淋巴細(xì)胞中的復(fù)制；他們認(rèn)為兩種方法機(jī)制不同，靶向部位不同，聯(lián)合使用可增強(qiáng)抑制效果［１］。JiYinduo等通過構(gòu)建針對金黃色葡萄球菌脂肪酸合成酶的反義表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染該菌后發(fā)現(xiàn)能抑制編碼基因的表達(dá)，使其生長受到明顯抑制，甚至停止［２］。
反義技術(shù)應(yīng)用于臨床治療也屢有報道：如利用人工合成的反義寡核苷酸抑制C-myc等致癌基因或腫瘤生長因子的表達(dá)等。
2反義RNA作用的雙重性
反義RNA不僅可以作為基因表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)因子，也可以作為正調(diào)節(jié)因子。例如：mRNAⅡ級結(jié)構(gòu)的形成有時會抑制其翻譯，設(shè)計阻止mRNAⅡ級結(jié)構(gòu)形成的反義RNA可促進(jìn)基因的表達(dá)。我們知道生物體內(nèi)某個基因表達(dá)不足或表達(dá)過度均會造成生物體的疾病。如細(xì)胞凋亡基因受促凋亡基因及抑凋亡基因的控制；正常表達(dá)時，在胚胎發(fā)育中可清除對機(jī)體無用的甚至有害的細(xì)胞，使組織器官結(jié)構(gòu)正常、形態(tài)完整；在成年機(jī)體去除衰老、損傷、癌變的細(xì)胞，并代之以新生的細(xì)胞，以維持器官中細(xì)胞數(shù)量穩(wěn)定和機(jī)體防御系統(tǒng)完整。若凋亡基因表達(dá)不足，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡受阻，會逐步發(fā)展成腫瘤；若表達(dá)過度，則造成組織器官發(fā)育缺陷或功能降低，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生一系列的病變。靶向促凋亡基因的反義RNA可抑制細(xì)胞凋亡；反之，則促進(jìn)細(xì)胞凋亡。由此我們可以看出，雖然反義RNA的作用是抑制同源基因的表達(dá)，但是由于靶目標(biāo)的不同，抑制結(jié)果卻截然相反。這就要求我們以全面系統(tǒng)的態(tài)度對待反義RNA。
3目前存在的問題及解決方法
3．1轉(zhuǎn)染效率：無論是載體表達(dá)的反義RNA還是體外合成的反義寡核苷酸，只有進(jìn)入靶細(xì)胞，才可與同源基因結(jié)合，發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，而且反義RNA調(diào)節(jié)具有明顯的劑量依賴性。裸露的反義寡核苷酸進(jìn)入細(xì)胞是一個內(nèi)化過程，效率很低；而帶有極性的反義寡核苷酸則是一個主動吸收過程，效率相對較高。然而，截至目前這一問題仍是反義RNA開發(fā)應(yīng)用中的最大瓶頸。細(xì)菌由于其特殊的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)染效率更低于真核細(xì)胞，這也是自反義RNA發(fā)現(xiàn)以來，較少用于原核細(xì)胞之原因所在。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及各種運送載體的出現(xiàn)和改進(jìn)，如利用脂質(zhì)體等介導(dǎo)反義分子；電轉(zhuǎn)染；噬菌體運用；改造反轉(zhuǎn)錄病毒，使其毒性降低，繼而攜帶反義分子進(jìn)入靶細(xì)胞等方法已使轉(zhuǎn)染效率明顯提高。Patrick等用陰性電荷的脂質(zhì)體包裹針對lacZ基因的反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染大腸桿菌，結(jié)果顯示有57%的大腸桿菌整合了包裹的反義寡核苷酸（游離反義寡核苷酸的整合率幾乎為零），并且測得β-半乳糖苷酶的活力下降了42%［３］。相信通過多學(xué)科聯(lián)合開發(fā)，以科學(xué)哲學(xué)的方法論和系統(tǒng)方法為指導(dǎo)，這一問題最終能得到解決。
3．2靶序列的選擇：許多研究結(jié)果表明：一些基因的反義沉默效果比另一些基因的好；同一基因，不同靶序列的沉默效果不同。靶序列的選擇除根據(jù)上述反義寡核苷酸的作用機(jī)制外，目前一定程度上依靠經(jīng)驗，不能完全由分析基因組來確定。真核細(xì)胞反義RNA的研究經(jīng)歷了二十余年，積累了較為豐富的經(jīng)驗，可用來指導(dǎo)原核細(xì)胞反義序列的設(shè)計。為了達(dá)到抑制、殺滅細(xì)菌或阻止其致病基因表達(dá)的目的，研究者一方面應(yīng)遵循系統(tǒng)方法論的最優(yōu)化原則，選擇靶基因、確定靶序列時，要統(tǒng)籌兼顧、整體協(xié)同，在多種方案中權(quán)衡得失，優(yōu)化選擇；另一方面應(yīng)本著科學(xué)精神，展開科學(xué)活動，及時歸納、總結(jié)，逐步完善設(shè)計原則，推動新型抗菌藥的研發(fā)，爭取早日用于臨床。
3．3給藥途徑：藥物在機(jī)體內(nèi)須達(dá)到一定的量并維持一定的時間才能發(fā)揮其藥理作用。也就是說，藥物首先應(yīng)能耐受機(jī)體某些酶的作用而不被分解，安全抵達(dá)靶細(xì)胞，同時對非目標(biāo)組織器官無毒副作用。事實上，目前尚無同時達(dá)到這兩項要求的藥物。俗話說：是藥三分毒。
這就要求我們把握系統(tǒng)與要素、要素與要素之間的相互影響、相互制約和相互作用，把握事物整體性質(zhì)及組成系統(tǒng)各要素間的聯(lián)系，尋找最優(yōu)結(jié)構(gòu)，獲得最佳功能。研究靶細(xì)胞的特異受體，選擇具有識別性能的配體，將反義分子連接在配體上，使反義分子準(zhǔn)確進(jìn)入靶細(xì)胞就是對這一原則的最好詮釋。
4反義RNA作為新型抗菌藥物的可能性：感染性疾病是由于病源菌在體內(nèi)生長、繁殖或機(jī)體正常菌群失調(diào)造成的。細(xì)菌本身的某些成份和/或生長代謝過程中產(chǎn)生的某些物質(zhì)對特定組織器官具有毒性作用，這些毒性物質(zhì)就是致病菌的毒力因子。核酸序列分析技術(shù)的迅猛發(fā)展，使探明編碼毒力因子的基因序列不成問題。根據(jù)基因序列設(shè)計相應(yīng)的反義RNA，借助運送載體轉(zhuǎn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，抑制致病基因或編碼細(xì)菌生長所必需的蛋白質(zhì)基因的表達(dá)，可以達(dá)到減毒、抑制或殺滅細(xì)菌的目的。這些反義分子是最具潛能的新型抗生素。Harth等針對結(jié)核分枝桿菌致病谷氨酰胺合成酶的mRNA設(shè)計了三條硫代修飾的反義寡核苷酸，通過加入到培養(yǎng)液共培養(yǎng)，檢測到其合成酶活性降低、細(xì)菌胞壁中的L-谷胺酸/谷氨酰胺的比例下降了24%，兩或三種反義寡核苷酸聯(lián)合使用可增強(qiáng)抑制效果［４］。White,D.G.等應(yīng)用靶向抗生素抗性基因啟動子的反義DNA類似物，經(jīng)熱休克和電穿孔引入E.coli，抑制了抗性基因的表達(dá)，證明外源性寡核苷酸的抑制效果［５］。還有研究者用四環(huán)素誘導(dǎo)載體表達(dá)反義RNA，使致病菌致病基因表達(dá)明顯下降，并用鼠的急、慢性感染試驗證實了這一點［６］。這些研究為將反義寡核苷酸開發(fā)成新型抗菌藥物奠定了理論和實驗基礎(chǔ)。動態(tài)追蹤各相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，充分加以吸收和利用，是此研究目標(biāo)不斷發(fā)展、進(jìn)步的基礎(chǔ)；只有用運動、變化、發(fā)展的觀點看待系統(tǒng)，看待要素，運用系統(tǒng)運動的基本規(guī)律，才能更好的認(rèn)識、把握和達(dá)到研究目標(biāo)。
參考文獻(xiàn)：
［１］Songkai Liu,Maria Asparuhova,Vincent Brondaniet al.2004.Inhibition ofHIV multiplicationby antisenseU7 snRNA andsiRNA targetingcyclophilinA[J]. NucleicAcids Research,2004,32(12):3752-3795.
［２］Yinduo Ji,Dezhong Yin,etc.Validation ofantibacterial mechanismof actionusing regulatedantisense RNAexpression_r inStaphylococcus aureus[J].FEMS MicrobiolgyLetters,2004,231:177-184.
［３］Patrick Fillion,Annie Desjardins,Khampoune Sayasithet al,2001.Encapsulation of DNAin negativelycharged liposomeand inhibitionof bacterialgene expression_rwith fluidliposome-encapsu latedantisenseoligonucleotides[J].Biochimicaet BiophysicaActa,2001,1515:44-54.
［４］Gunter Harth,Paul C.Zamecnik, Jin-YanTang, etal.Treatment ofM ycobacteriumtuberculosis withantisense oligonucleotidesto glutaminesynthetase mRNAinhibits glutaminesynth etaseactivity, formationof thepoly-L-glutamateyglutamine cellwall structureand bacterialreplication[J].PNAS,2000,Vol(1):418-423.
［５］WHITE DG,MANEEWANNAKUL K,HOFEE.von etal.Inhibition ofthe multip leantibiotic resistance(mar) operonin Escherichiacoli byantisense DNAanalo gs.Antimicrobial. Agentsand chemotherapy,1997,12:2699-2704.
［６］Yindao ji,Andrea marra,MartinRosenberg, etal.Regulated antisenseRNA eliminiatesAlpha-Toxin virulencein Staphylococuusaureus infection[J].Journ al ofbacteriology,1999,6 585-6590.
