生物芯片與第二代測序技術是兩種重要的高通量基因組學研究方法，在生命科學研究領域有著極其廣泛的應用前景。經(jīng)過近20年的發(fā)展，生物芯片技術逐漸成熟，正在向著“高密度，靈活定制，微量樣品”的方向發(fā)展，從一個實驗室技術發(fā)展成一個基因組學研究所依賴的，快速產(chǎn)生海量數(shù)據(jù)的常規(guī)手段，正在逐步走向產(chǎn)業(yè)化。第二代測序技術是最近幾年建立的高通量技術，其特點是一次測序反應可以產(chǎn)生千萬到億條序列，而測序的成本大大降低，到2010年已經(jīng)進入數(shù)千美元測定一個人全基因組的時代。

那么，二代測序會不會取代芯片技術呢？是不是Sanger測序（一代測序不用了呢）？下面主要針對在一個帖子上發(fā)的問題總結一下，主要討論二代測序與基因芯片的區(qū)別與優(yōu)缺點：

討論 1 二代測序與基因芯片的區(qū)別與優(yōu)缺點。

生物芯片與第二代測序都是基因組學研究的重要手段。經(jīng)過近20多年的發(fā)展，生物芯片相對第二代測序而言，優(yōu)勢在于價格便宜，便于分析。缺點則在于必須有參考序列（因為生物芯片的探針設計就是根據(jù)參考序列設計的）。當然還有很多技術上的優(yōu)缺點，這里主要討論他們的本質，來消除很多人對于二者的誤解，認為基因芯片被二代測序取代至少在目前看來還是比較片面的。

相同點：

高通量和一些應用領域上的重合（比如表達譜，SNP）

不同點：

1.本質不同：

基因芯片的本質是核酸雜交。只不過是同時進行上萬個核酸雜交而已；第二代測序在本質上是PCR.先用PCR的方法構建測序文庫（SOLiD的油包水PCR，Solexa的橋式PCR），隨后再以“邊合成邊測序”或者“連接介導的測序”，得到序列信息。

2.應用不同：

由于是核酸雜交，不需要擴增。因此基因芯片是個相對封閉的系統(tǒng)，只能檢測序列已知的片段的濃度；另外，由于不需要擴增，保真性也較好。第二代測序本質上是測序，因此是個開放的系統(tǒng)，能檢測到那些沒有參考序列的片段，并且給出序列。由于在構建測序文庫的過程中有PCR放大的過程，因此相對靈敏度較高（需要高覆蓋倍數(shù)的測序深度配合），但也由于PCR放大過程的不均衡性，樣品中片段的內在濃度比例常常會被破壞掉。所以：
（1）microarray不能發(fā)現(xiàn)新序列，而NGS可以發(fā)現(xiàn)一些以前沒有檢測到的基因。

（2）由于NGS本質上還是PCR，在建庫的過程中樣本被擴增上千倍，因此樣本中基因的量的線性關系會有所偏差。因此NGS定量不是很好。如果想檢測基因的表達量，還是用microarray的好。

因此，基因芯片和第二代測序技術在應用上雖然有交集，但還是有差別的。如果是比較參考序列良好的物種的表達譜，基因芯片好一些，而且基因芯片發(fā)展成熟，后續(xù)數(shù)據(jù)分析較方便。而如果想發(fā)現(xiàn)新的轉錄本，或者研究基因表達的可變剪接，3’UTR的變化等等，還是用第二代測序的好。我們現(xiàn)在傾向于認為基因芯片和第二代測序技術是兩種不同的技術，兩者有交集，但更多的是不同。至于選擇哪種技術，還是要看具體想解決的問題是什么。簡而言之，如果是想發(fā)現(xiàn)新東西，做探索性的實驗，用NGS好些。如果研究對象是那些已知的東西，對定量的準確度要求很高，那么還是microarray的好。還有很多研究當基因組信息未知的時候，先用NGS測序全基因組序列，再用microarray進行分析。

討論 2.Sanger與二代測序的比較

一下問題我想用在一個網(wǎng)站（后面有鏈接）上的帖子來說明。帖子挺好的，建議大家看看

問題：現(xiàn)在有幾株噬菌體需要測序，不知道選用哪種方法好。一類是傳統(tǒng)的sanger法，另一類是solexa。如果用solexa測的話，小基因組可能會有比較多的gaps，拼接效果沒有sanger法好，但是費用低。我們的噬菌體基因組在１００ｋｂ左右。請問我選用哪種方法好呢？謝謝！

答:如果你只有一株噬菌體的話，我建議你用Sanger法測序。100Kb的基因組很小，保守假設Sanger法測序每次能測500bp，那么理論上只需200次就可以覆蓋一次基因組了，而且數(shù)據(jù)質量好，價格也不貴。
但是，如果你有好幾株噬菌體的話，我還是建議你用第二代測序，因為可以設置Barcode，好幾株噬菌體一起測序，這樣測序的費用會大大降低。但是如果是denovo 測序的話都存在需要用sanger法補gap的可能性。

討論 3.關于二代測序的幾種方法

問題1.我想問下各個基因組測序方法之間的區(qū)別是什么？例如solex和denovo測序法。

答: Solexa并不是一種測序方法，而是一種第二次測序儀器。
目前，第二代測序的儀器主要有3家：（1）Roche 454 Genome Sequencer FLX；（2）IlluminaGenome Analyzer IIx （Solexa）；（3）ABISOLiD3。當然Illumina和ABI現(xiàn)在都已經(jīng)發(fā)布了新的測序儀，分別是Hiseq 2000和SOLiD4。
關于測序方法，則主要是以下幾類：
1、De novo測序：即從頭測序，不需要任何現(xiàn)有的序列資料就可以對某個物種進行測序，利用生物信息學分析手段對序列進行拼接，組裝，從而獲得該物種的基因組圖譜。
2、基因組重測序：對有Reference Sequence的物種進行測序，尋找基因差異。
3、轉錄組測序：對轉錄組(RNA)進行測序。
此外，還有第二代測序與其它技術相結合，還有ChIP-Seq；甲基化測序等。

問題2.我是在讀碩士，老板說我的課題方向做某種微生物的全基因組測序。但該生物的基因NCBI上，還有必要測嗎？如果要測，請問我要提供什么樣品？量為多少？測序后的拼接是你們做還是我們自己做？測完后可以做什么分析？做這種低等生物的全基因組測序，周期大概多長？

答:如果已經(jīng)存在參考序列，那么再測一次就叫做重測序（re-sequence）。重測序的話，可以發(fā)現(xiàn)基因組的改變，一些SNV，smallindel等。這些都很有意義。
例如：研究某種微生物的耐藥性。那么可以將已經(jīng)產(chǎn)生耐藥性的菌株重測序，與參考相比較，發(fā)現(xiàn)有哪些基因發(fā)生改變，那些基因可能正是耐藥性產(chǎn)生的根源。
如果要測序的話，提供DNA就可以了，5微克應該夠了。測序后的拼接和數(shù)據(jù)分析，上海伯豪都有專門的生物信息學團隊完成。測序周期的話要根據(jù)測序量來定。

問題3.請問如果要對人類的腫瘤組織進行全基因組測序，是進行de novo 還是Re-Sequence？人類的全基因組測序結果已經(jīng)公布（千人基因組），但是腫瘤組織每種腫瘤、不同病理類型、不同種族差異很大。

答：對人類樣本測序都是Re-Sequence。因為已經(jīng)有參考序列，在NGS中，參考序列的意義是搭建一個框架，然后NGS得到的數(shù)據(jù)就可以根據(jù)這個框架搭建上去（拼接）。
雖然不同的個體，不同的腫瘤組織基因組序列不同，但是框架是一樣的。NGS得到的數(shù)據(jù)依靠框架重新拼接起來，就可以得到各個組織獨特的基因組序列。

討論 4.關于SNP和GWAS

問題1.如果我要對一個病人的家系做全基因組測序，以探求其可能的致病基因，應該用什么樣的方法比較好？做GWAS都有什么儀器？羅氏454是不是其中一種？

答：GWAS（全基因組連鎖分析）是指比較病人群體和正常人群體之間的基因、外顯子或SNP差異，從而找到致病基因的技術路線，目前比較流行。您對家系的研究不算GWAS。GWAS是散發(fā)型的Case/control的研究，一般樣本量大于800例。您對家系的研究，應該算是連鎖分析（linkage），需要至少垂直三代的數(shù)據(jù)。但是比GWAS還是少得多。目前比較病人群體與正常人群體之間的差異，一般有第二代測序（NGS）和生物芯片（microarray）兩類。
NGS：基因組重測序（比較基因組差異）；外顯子捕獲測序（比較外顯子編碼差異）。
microarray：SNP芯片（比較SNP差異）；CGH芯片（比較基因組結構差異）
你所說的羅氏454是第二代測序的一種，可以用來做連鎖分析。但是羅氏454費用較高，一般不推薦。一般推薦ABISOLiD，因為您的研究對象是人，參考序列良好，而SOLiD測序準確率高。

問題2.根據(jù)NCBI上可以得到線蟲的SNP，我從一顆樹上取下一推線蟲（由于線蟲太小，無法分離）來提取基因組，想通過再測序知道我的樣本中SNP是否與數(shù)據(jù)庫一致，另外還想知道SNP發(fā)生的頻率是多少。請問哪種方法可以得到我想要的結果呢？

答：你的樣本實際上是一個線蟲基因組DNAPool。這樣的樣本拿來測序，得到的數(shù)據(jù)是可以與NCBI數(shù)據(jù)庫比對的，你可以發(fā)現(xiàn)一些那棵樹上的線蟲種群所特有的SNP位點。但是，以此來推算SNP位點的頻率是不行的。因為那個線蟲基因組DNAPool是不均勻的。

舉個例子，那棵樹上有兩只線蟲A和B。A的基因組大些，為2ug；B的基因組小些，為1ug。在某個SNP位點，線蟲A為C，線蟲B為T。

然后你逮到了線蟲A和B，然后混合提取基因組DNA。所提取到的基因組DNApool為3ug（A占2ug，B占1ug）。假設測序的擴增過程是完全線性的，那么最后的測序結果中，在那個SNP位點，67%的比率為C，33%的比率為T。

這樣的測序結果，你能說在這個SNP位點C的頻率為67%嗎？當然是不能的。

因此。你想發(fā)現(xiàn)新的SNP位點是可以的。但是想估算SNP頻率是不行的。

討論 5. 關于轉錄組測序

問題1.請問全轉錄組測序，可以同時檢測mRNA、miRNA及其他非編碼RNA嗎？

答:首先需要向您講明一個事實。目前，第二代測序的長度有不同的選擇。SolexaGAIIx的測序長度是36bp，75bp和100bp；ABISOLiD3的測序長度是25bp和50bp。不同的測序長度的費用是不同的！目前，我們通常根據(jù)測序樣品長度的不同而選擇不同的測序長度。例如：mRNA測序通常會需要75bp的讀長，而microRNA則只需要36bp或者50bp的讀長就足夠了。
關于您所提的問題，技術上是可行的，我們可以以75bp的讀長測mRNA的同時測其中包含的microRNA。但是在經(jīng)濟上是不劃算的。microRNA比較短，PCR擴增倍數(shù)多，形成的cluster多，占用了很多本該屬于mRNA測序的資源，而它們本身又用不完75bp的讀長，所以造成浪費。
一般來講，如果要進行 microRNA測序的話。我們希望能將microRNA分離出來，單獨測序。

問題2. 請 教miRNA芯片服務和LncRNA芯片服務的價格比較簡單的技術區(qū)別。

答：miRNA芯片和LncRNA芯片實際上是兩類相差很大的芯片。miRNA比較短，因此芯片公司在設計檢測miRNA的探針時，在探針頭部加了一個發(fā)夾結構，整個探針像一個鉤子一樣。這樣能將microRNA前體與成熟的microRNA區(qū)分開，提高檢測的特異性。而LncRNA比較長，檢測LncRNA的探針設計和普通mRNA一樣。目前LncRNA的研究還不深入，對于生物芯片之類比較依賴于參考序列的實驗技術來講，LncRNA芯片不是很成熟。因此，如果您是想比較兩組樣品之間miRNA的差異表達，可以選用microRNA芯片（定量較準）。如果您是想發(fā)現(xiàn)新的microRNA，或者對LncRNA進行研究。我建議您使用第二代測序。

生物芯片與第二代測序技術丁香園答疑帖精選（上）

http://www.ebioservice.com/show_news.asp?id=770

生物芯片與第二代測序技術丁香園答疑帖精選（下）

http://www.ebioservice.com/show_news.asp?id=1259

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