愛華網(wǎng)根據(jù)蛋白質(zhì)保守區(qū)設(shè)計簡并引物擴增出部分片段是克隆蛋白質(zhì)家族基因的首要的一步，這兒我發(fā)現(xiàn)了一個好工具，與大家共享，可是我還不太會用，如果有用得很熟的不知道是否可以說一說使用的方法和體會。
http://blocks.fhcrc.org/blocks/codehop.html
我用過。
網(wǎng)址是：http://blocks.fhcrc.org/blocks/make_blocks.html，進入后，
1. 框中填入所有（或部分）同源蛋白的氨基酸序列（FASTA格式，這可以從基因銀行中找到），然后擊“makeblock”,
2.出現(xiàn)“ Making your blocks, please wait...
Your results will be available for approximately 24 hours here.”，擊“here”
3.出現(xiàn)"Block Maker Results" sucha as A B C etc.下面是很多Blocks.
4. If you click Map 旁的"Graphical map"，進入后，Sequence一項中，一直線上顏色相同的框代表保守的Domain(Its number vary amongdifferent sequence, 2.3.4 or more).
5. 如果你是設(shè)計引物，擊Primers旁 的 [CODEHOP]，進入后，里面有許多選項，- degeneracy[default=128]:
- strictness [default=0.0]:
- temperature [default=60.0]:
- poly-nuc [default=5]:
這些選項你可以增加或減少（根據(jù)你的需要)，
Then click"Look for primer"
6 進去后，就是軟件設(shè)計好的兼并引物。 有的Block,可能沒有引物（ No suggested primersfound.有的Block, 上面是amino acid sequence, 下面是相對應的引物。每個Block都有Forwardand Reverse primer.
If there is no primer, you can increase the strictness,
這個程序設(shè)計的引物由5‘的clamp(specific)and 3'end的core(degenerated)序列。我用這個程序設(shè)計引物成功分離出基因片斷。但是， 我不完全用它的序列，稍微改動：
1， 我要查文章， 找到該 同源基因的保守Domain(往往這些domain也是block ),從這些block種找引物。
2。3‘core 序列只有11個nucleotide sequence is degenrated, 我往往查一些基因的序列，再3‘core前面的一個amino acid sequence 也讓他兼并。
3。 5‘clamp 序列太長，我都去掉一些， 讓整個引物的長度為22-24個堿基就可。
4。由于該引物有clamp and core組成， 有一篇文章， 介紹PCR programme which iscomplex.Now I do not have the article on hand. If you want , pleasetell me(quanzi@hawaii.edu) . But, after I adjust the primer, I usethe norman programe. For example, 94 degree 50s, 50-56degree 50s,72degree30s-2mins. 30-35cycles.
The article is"Consensus-Degenerated Hybrid oligonucleotideprimer for amplification of priming glycosyltransferase genes ofthe exopolysaccharide locus in strains of the lactobacillus caseigroup",magazine is Applied and Environmental Microbiology,publishedin June 2003, volume69,p 3299-3307.
