如何認識肌酸激酶同工酶CK-MB？

肌酸激酶同工酶有三種，即CK-MB、CK-BB和CK-MM。其中CK-BB主要存在于大腦、腎、前列腺及子宮組織；CK-MM主要存在于骨骼肌、心?。欢鳦K-MB則主要存在于心肌。雖然血清肌酸激酶（CK）是診斷心肌梗死的一個極其靈敏的指標，但其對于心肌損害診斷的特異性不及CK-MB。急性心肌梗死發(fā)作在胸痛出現(xiàn)后3小時左右即開始增高，16-24小時達最高峰，72小時后恢復(fù)正常。臨床及時測定CK-MB診斷心肌梗死的靈敏度基本為100%。CK-MB的檢測結(jié)果以國際單位/升（IU/L）表示。

血清肌酸激酶同工酶CK-MB正常參考值是多少？

酶連續(xù)監(jiān)測法CK-MB <25IU/L

CK-MB作為AMI診斷依據(jù)時應(yīng)大于正常上限值的2倍.

血清肌酸激酶同工酶CK-MB異常有何臨床意義?

CK-MB活性增高是心肌損害的特異性指標,對心肌梗死早期診斷很有價值.同時,CK-MB早達峰值者比晚達峰值者預(yù)后要好。

肌酸激酶同工酶CK-MB檢測時應(yīng)該注意什么？

無需空腹，采不抗凝靜脈血，分離血清進行測定，避免溶血。

肌酸激酶測定

酶偶聯(lián)測定法

1.原理

CK催化磷酸肌酸(CrP)與二磷酸腺苷(ADP)反應(yīng)產(chǎn)生三磷酸腺苷(ATP)與肌酸(Cr)；偶聯(lián)已糖激酶(HK)及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PD)的催化反應(yīng)。HK催化葡萄糖(Glu)與ATP反應(yīng)，形成葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)，G-6-PD催

2.試劑

3.操作

具體操作根據(jù)各醫(yī)院分析儀類型及試劑說明書而定

(1)吸2mL應(yīng)用試劑I入測定管中，加100μL血清。混合，放人37℃水浴至少5min。

(2)在37℃水浴中預(yù)溫應(yīng)用試劑Ⅱ至少5min。

(3)加入200μL應(yīng)用試劑Ⅱ，混合，轉(zhuǎn)入3mL比色杯(10mm光徑)，立即放入恒溫比色槽內(nèi)。

(4)待120s的延遲期后，用340nm波長連續(xù)記錄吸光度的改變，用反應(yīng)速率曲線的線性部分計算CK活力。

4.計算

CK （U/L）=△A/ min× ×

=△A/ min×3698

2.30：反應(yīng)液的總體積(mL)

0.10：血清用量(mL)

6220：NADPH在340nm的摩爾吸光度

△A/ min：平均每分鐘的吸光度變化值

5.參考值范圍

成年男性參考值上限為180U/L(37℃)，女性為130 U/L(37℃)。

6.注意事項

(1)本法線性至少達3000U/L，更高活力的血清用已知CK活性正常的血清稀釋后再測。

(2)中華醫(yī)學(xué)會檢驗學(xué)會酶學(xué)小組推薦酶催化反應(yīng)溫度均為37℃，文獻報道CK測定以30℃為好。

(3)試劑空白的速率(△A／min)應(yīng)小于0.001，即小于3.7 U/L。

(4)EDTA可防止NAC由于二價離子催化發(fā)生的氧化，有利于試劑的穩(wěn)定。

(5)血清Ca2+是Mg2+的競爭性抑制劑。加入2mmol／L的EDTA可消除Ca2+的影響：Mg2+為10mmol／L時，雖與EDTA結(jié)合，但不影響對CK的激活。血清中存有內(nèi)源性的抑制劑，表觀CK活力隨血清稀釋倍數(shù)增加而增加，故不宜用鹽水稀釋。

(6)紅細胞及幾乎所有組織中含有腺苷酸激酶(AK)，催化下列反應(yīng)：

2ADP———>ATP+AMP

反應(yīng)中產(chǎn)生的ATP導(dǎo)致表觀CK活力增加。氟化物、AMP及AP5A抑制AK活性。氟離子可與鎂離子形成不溶性的MgF2，故不宜用氟化物為抑制劑。AMP是AK的競爭性抑制劑，引起AK催化反應(yīng)的產(chǎn)物抑制。AP5A競爭性地抑制肌肉及紅細胞的AK，對肝及腎的AK很少抑制。5mmol/LAMP與10μmol/L AP5A合用，能有效地抑制紅細胞及肝的AK。

(7)CK活性不穩(wěn)定，血清保存時易喪失。保存的血清標本中不需加巰基試劑，反應(yīng)液中含的EDTA及NAC可使4℃保存1周的血清CK重新激活達99％。

(8)紅細胞不含CK，輕度溶血無影響。中度及重度溶血時，因紅細胞釋出的AK、ATP及G6P影響延遲相及產(chǎn)生副反應(yīng)。

五、CK同工酶的測定

(一) 標本采集、處理和貯存

CK同工酶檢測血清和血漿均可。在4℃可保存數(shù)天，-15℃可保存2周，若用血漿宜用EGTA，而不用EDTA抗凝。冷凍血漿測定時，應(yīng)在30℃以下融化，需反復(fù)冰融者應(yīng)加還原劑——巰基乙醇以穩(wěn)定酶活性，速凍及貯存于-20℃或-70℃，在有β-巰基乙醇和EGTA存在時，MM和MB可穩(wěn)定數(shù)年，而BB則僅穩(wěn)定半年。由于CK同工酶半衰期短，故酶活性的高低受標本采集時間的影響較大。

瓊脂糖凝膠電泳法

1.原理

CK分子是由M和B兩種亞單位組成的二聚體，在電泳條件下，CK-BB遷移最快，CK-MB居中，CK-MM最慢。電泳后進行酶促反應(yīng)顯色，觀察結(jié)果。顯色原理是：CK催化磷酸肌酸(CrP)及ADP，產(chǎn)生肌酸(Cr)及ATP，在偶聯(lián)的HK催化下葡萄糖被ATP磷酸化，形成G-6-P；在偶聯(lián)的G-6-PD催化下G-6-P被NADP+氧化，形成6-P-G，同時NADP+還原為NADPH。在365nm觀察NADPH的熒光或用熒光光密度計掃描定量。也可用四氮唑鹽顯色法，即利用酚嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)將NADPH的氫傳遞給氯化碘代硝基四唑(INT)，使其還原成紫紅色的甲鐟，顯示CK同工酶區(qū)帶。

2.試劑

3.操作

(1)隔水煮沸溶解試劑“③”，取1.5mL鋪于1～1.2mm厚的載玻片上。于近陰極端并行挖兩個槽，作兩份標本，或作標本與控制物。

(2)加樣5μL，80V電泳50min。

(3)合理安排配制混合底物顯色液的時間，使配制完成時電泳結(jié)束。

(4)將電泳凝膠板置涂以黑漆的鋁盒中，吸底物顯色液1.5mL鋪于凝膠板上，加蓋，待凝后置37℃水浴1小時。

(5)置固定液(乙醇：醋酸：水＝150:10:40)中2～4小時，轉(zhuǎn)入蒸餾水中數(shù)小時，取出觀察結(jié)果或用光密度計在500nm波長下掃描定量。需要時可平推至空白卡片紙上，37℃孵箱過夜，干片保存?；蛴脽oPMS、INT底物顯色液，37℃水箱孵育20min。

(6)再置60℃干燥箱中20min,在紫外燈(365nm)下觀察熒光。有條件者用熒光光密度計掃描定量，激發(fā)波長

4.結(jié)果觀察

瓊脂糖凝膠電泳法的結(jié)果觀察如圖9-14所示。

5.注意事項

廣泛存在于各種組織的腺苷酸激酶(AK)催化ADP產(chǎn)生ATP，干擾同工酶結(jié)果的判斷。加入AMP可抑制此反應(yīng)，但過量AMP也抑制CK。NaF抑制AK，不抑制CK，與AMP合用可抑制各種AK同工酶的97％。NaF與CK激活劑Mg2+可逐漸形成MgF2沉淀，所以，NaF與Mg2+分開配制，臨時混合，不影響各自的作用。電泳需較高pH，酶反應(yīng)需較低pH，本法中用低離子強度，pH低于8.6的電泳緩沖液；高離子強度，pH低于6.7的基質(zhì)緩沖液。當含瓊脂糖的基質(zhì)顯色劑覆蓋于電泳后的凝膠板，上下凝膠中的成分相互擴散后的pH，恰為酶作用的最適pH。Bis-Tris全名為Bis(2-羥乙基)亞氨基-Tris(羥甲基)甲烷，25℃時pKa＝6.46，是CK同工酶。測定優(yōu)選的緩沖劑，200mmol/L時，CK活力最大。如無Bis-Tris；亦可用咪唑加EDTA作基質(zhì)緩沖液。EDTA作Ca2+的絡(luò)合劑，因Ca2+抑制CK活力。血清CK活力隨溫度升高而增加，直至45℃；更高溫度迅速下降，56℃時很快失活。瓊脂糖電泳法測CK同工酶，絕不能象作LDH同工酶用溫度較高的瓊脂糖基質(zhì)顯色液，否則CK活力喪失。而非脫氫酶反應(yīng)(Nothingdehydogenase，NDH)顯著。NDH是相當于白蛋白及β球蛋白區(qū)帶處的紫紅色區(qū)帶，與蛋白質(zhì)的巰基有關(guān)，標本用量大，pH高時尤其明顯，僅四唑鹽及PMS就可與標本產(chǎn)生，用測NADPH熒光法可避免。本法中標本用量少，顯色時pH較低，NDH反應(yīng)不明顯。CK是巰基酶，絕對需要巰基試劑活化。但巰基試劑可還原四唑鹽，N-乙酰半胱氨酸及谷胱甘肽還原四唑鹽能力弱，可使背景清晰。PVP是隋性聚合體，作為酶擴散的障礙物加入，可改善區(qū)帶分離效果。CK不穩(wěn)定，對光、熱及高pH敏感，最好將及時分出的血清充C02后塞緊管口，置冰室或-30℃保存，至少可穩(wěn)定半個月，及時測定更好。不主張加巰基活化劑保存。影響CK同工酶電泳與顯色的因素很多，必須同時作控制物。

控制物制備方法：取小白鼠心、股四頭肌、腦，分別在pH7.2緩沖液(50mmol／LTris-HCl，250mmol／L蔗糖，10mmol/LEDTA，10mmol／L還原型谷胱甘肽)中勻漿，10000g離心l5分鐘。取上清液，測CK活力。再用此pH7.2緩沖液稀釋到200U／L左右，分裝后置-30℃保存。用前取出置室溫融化后將三種組織的控制物等量混合使用(可節(jié)省基質(zhì))。如凍干，用前以正常人血清重建并混合，除CK-MM、CK-MB及CK-BB外，在CK-MM與CK-MB之間出現(xiàn)一條帶，是CK-Ig的復(fù)合物，稱大CK1型。

六、臨床應(yīng)用

CK及其同工酶是目前世界上臨床測定次數(shù)最多的酶，80年代初期統(tǒng)計分別達一億次和一千萬次。這是因為CK在骨骼肌、心肌和腦疾患時常明顯升高，如同時測定同工酶還有助于疾病的鑒別診斷。表9－1是各種疾病時總CK和CK同工酶的變化。

這里酶的測定主要用于早期診斷AMI和判斷溶栓治療的療效以及判斷疾病預(yù)后，特別在無Q波型AMI，此時心電圖無Q波變化，常需其它檢查來協(xié)助臨床醫(yī)師診斷和鑒別診斷AMI。目前有些國外學(xué)者認為在診斷AMI不需要同時作許多酶，只要單測CK一項即可。這是因為：

1.心肌細胞含有大量CK：按每克組織含酶量計算，CK超過天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST，即谷草轉(zhuǎn)氨酶)和乳酸脫氫酶(LD)等。所以當發(fā)生AMI、心肌細胞壞死時，釋放出來的CK量超過其它酶。

2.CK由于分子量不大，而且大量存在于胞質(zhì)中，所以在各種酶中最早進入血液：一般在AMI后4～8小時就可能超過參考值上限。LD由于分子量大(約為125000)，故增高明顯遲于其它酶。同樣線粒體中的酶，如線粒體AST在血中濃度升高明顯推遲。

3.由于CK主要存在于肌肉組織中，其它臟器如肝、腎、血細胞中含量極微：在診斷AMI時，其特異性遠比一般代謝酶如LD、AST等為高，特別是溶血標本對CK測定結(jié)果影響較小。近年來國內(nèi)廣泛使用動態(tài)法測定酶活性，大大提高了CK測定的準確性和重復(fù)性，并且可以在很短時間(約5分鐘)測定完畢，特別適合于急診患者。但CK測定的局限性也很明顯，由于CK大量存在于3種肌肉組織中，尤其是骨骼肌中CK含量不論按濃度含量或按全身總量計算都大大超過心肌。因此骨骼肌局部或全身疾病都很容易引起血中總CK活性升高。血CK的極度增高主要見于全身疾病。曾有一例橫紋肌溶解癥患者，血中CK含量高達100000U/L，而在AMI時，就是大面積梗死，血中CK含量也很少超過3000U/L。肌注某些藥物也可能引起，CK一過性升高，但一般不超過正常上限值的2倍，持續(xù)時間不超過1天。因此國外有些醫(yī)院將CK參考值上限的2倍作為診斷AMI的判斷值，以減少假陽性：盡管CK測定診斷AMI的靈敏度很高，但特異性卻明顯偏低，其假陽性率達15％～30％；CK在體內(nèi)的半壽期明顯比其它酶短，心肌組織一次梗死后，CK急劇升高并很快恢復(fù)正常(48～72小時)，這樣在亞急性心肌梗死時CK可能正常，但其它酶如AST，特別是LD很可能居高不下。

以往對于CK診斷AMI常強調(diào)下列幾點：1.AMI發(fā)病后8小時內(nèi)查血CK不高，不應(yīng)輕易除外AMI診斷，并以此結(jié)果作為基礎(chǔ)值，和以后測定值作比較，任何懷疑AMI者應(yīng)盡早抽血送檢；2.發(fā)病后24小時CK測定結(jié)果臨床意義最大，因為此時正當CK的峰值時間，如不超過正常值上限可排除AMI診斷；3.發(fā)病后48小時內(nèi)應(yīng)多次測CK活性，如不出現(xiàn)一個典型升高和下降的過程，應(yīng)懷疑AMI的診斷。

近年文獻指出，某些AMI患者血中CK可以不超過正常值，特別是不超過參考值上限的2倍，這些病例多見于無Q波心肌梗死。長期以來認為CK峰值高低對AMI預(yù)后判斷有一定價值。CK-MB由于大量存在于心肌組織中，其他組織和器官中含量很少，所以CK-MB是目前診斷AMI的一個極其可靠的生化指標，特異性可達95%乃至更高。一般認為其敏感度比CK總活性稍差，但也有文獻報道，約有12.5%AMI患者總CK不高，但CK-MB超過正常。AMI不同時期CK同工酶電泳圖譜變化如圖9－15所示。

CK-MB測定方法和試劑盒很多，同一標本在不同實驗室往往結(jié)果不同。從測定原理來分，可分為測酶活性與酶質(zhì)量兩大類方法。第一類方法先用物理、化學(xué)和免疫等各種手段將CK－MB和其它同工酶分開，然后根據(jù)酶的催化活性測CK-MB濃度，用活性單位/升(U/L)或百分比報告結(jié)果。測酶質(zhì)量方法則是利用CK-MB的抗原性，根據(jù)抗原抗體反應(yīng)測CK—MB酶蛋白濃度，單位為μg/L。兩者結(jié)果有時不一致，因為如酶變性失活但仍保留抗原性，此時用測酶活性的方法結(jié)果不高，但用測質(zhì)量方法可以增高。80年代早期德國學(xué)者根據(jù)此結(jié)果認為AMI患者血中存在著滅活的CK。但最近用改進方法測CK-MB，發(fā)現(xiàn)兩法差異不大。國內(nèi)普遍使用測酶活性方法，目前較多使用電泳方法分離CK-MB。電泳法特點是準確可靠，當出現(xiàn)一些異常同工酶如巨CKⅠ、巨CKⅡ等，從電泳圖譜上很容易發(fā)現(xiàn)，并可通過光密度計進行定量測定，不會將CK-BB和各種異常同工酶誤認為是CK-MB而誤診。其主要缺點是靈敏度較差。

近年來國內(nèi)一些單位用免疫抑制法測CK-MB，其原理為抗M亞單位的抗血清可以和CK-MM及CK-MB中的M亞單位形成抗原抗體復(fù)合物，從而完全抑制M亞單位的酶活性，因為正常血清中幾乎無CK-BB，故將此值乘以2可以認為大致代表CK-MB的活性。此法簡單迅速，缺點是特異性差，如患者血清中還存在著CK-BB或者異常CK時，都將出現(xiàn)假陽性。故可作為過篩試驗，如有疑問時用電泳法核實。另外此法正常值明顯高于其它方法。如Sclavo公司試劑盒的正常值為18U/L，而電泳等其它方法都是<5U/L。有人認為這是因為CK-MM還可以進一步分為若干亞型，一般抗MM血清對MM3抑制較好，但對MM1抑制較差，而正常情況下血中MM亞型的存在以MMl為主，故導(dǎo)致正常值明顯偏高。AMI第一天血中以MM3為主，但第二天以后則以MMl為主，因此使用此類方法診斷AMI和解釋結(jié)果時應(yīng)謹慎。

國外從20世紀80年代初建立了多種測CK-MB酶質(zhì)量的方法。應(yīng)用最多的是美國Hybriteeh公司的ELISA方法，正常人在5μg/L以下，此法結(jié)果和電泳法相關(guān)良好。缺點是測定時間長達半天，只適合成批標本。近兩年來應(yīng)用單克隆技術(shù)制備出特異性極高的只和CK-MB作用的抗血清，已有多種試劑盒供應(yīng)。最近Deerson以CK-MB≥10μg/L以及CK-MB指數(shù)≥3.0(μg/UCK×l00)為AMI診斷標準。CK-MB單克隆抗體方法簡單，特異性高，是目前重點發(fā)展的方法，近來有人認為此法有助于不穩(wěn)定型心絞痛的診斷；可惜國內(nèi)應(yīng)用不多。

CK-MB的局限性在于骨骼肌損傷時也可能釋放出一定量的CK-MB。雖一般認為骨骼肌含有的CK-MB在總CK中不超過5％，但也有例外。Evans報道1例橫紋肌肉瘤的CK-MB高達274U/L，占總CK的28％。因此當CK-MB增高時，臨床也應(yīng)考慮有無非心肌來源的可能性。

骨骼肌中有大量CK，所以CK明顯升高(3000U/L)大都見于肌肉疾病。此時CK測定用于鑒別肌萎縮病因，如Duchenne型和Becker型肌萎縮患者，常在臨床前期血中CK就可中度和高度增加。該病是伴性遺傳，在75％女性Duchenne型肌萎縮攜帶者和50％女性Becker型肌萎縮攜帶者血中也可查到CK升高。此外各種原因(病毒，細菌和寄生蟲)引起的肌肉感染性疾病都能引起CK升高。但由于神經(jīng)疾病引起的肌萎縮癥，CK常不增高。

腦中雖含有較大量CK，腦血管意外時有大量CK釋放入組織間隙，但由于血腦屏障存在，只能在部分病例中查到血中和腦脊液中CK升高，以及出現(xiàn)CK-BB，但陽性率不高，這妨礙了CK在這方面的臨床應(yīng)用。

人胚胎期主要為CK-BB，有人根據(jù)“癌胚”理論，提出CK-BB可作為腫瘤標記物，可惜的是陽性率不高，只占惡性腫瘤10％左右。