愛華網(wǎng)質(zhì)粒(Plasmid)：獨(dú)立于染色體外的，能自主復(fù)制且穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。是一種環(huán)狀的雙鏈DNA分子。存在于細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動(dòng)植物細(xì)胞中，在細(xì)菌細(xì)胞中最多。
藍(lán)白斑篩選：
現(xiàn)在常用的質(zhì)粒載體上都帶有β-半乳糖激酶（LacZ）基因。載體上重組DNA的插入位點(diǎn)存在于特定遺傳標(biāo)記內(nèi)部，外源DNA片段的插入會導(dǎo)致該遺傳標(biāo)記失活。本實(shí)驗(yàn)使用的載體含一個(gè)大腸桿菌DNA的小片段，其中含乳糖操縱子的啟動(dòng)子和β-半乳糖激酶基因，多克隆位點(diǎn)位于其編碼區(qū)內(nèi)。載體與編碼β-半乳糖激酶C端的部分序列的宿主之間發(fā)生互補(bǔ)——α-互補(bǔ)，產(chǎn)生完整的β-半乳糖激酶活性的Lac+細(xì)菌。它們在生色底物存在下形成藍(lán)色菌落。當(dāng)外源DNA插入多克隆位點(diǎn)時(shí)，細(xì)菌不能產(chǎn)生β-半乳糖激酶，即使有生色底物存在，一般也會產(chǎn)生白色菌落。而無插入片段的重組細(xì)胞菌落將產(chǎn)生藍(lán)色菌落。X-gal和IPTG是被用于鑒別藍(lán)白菌落的底物，常涂布于固體培養(yǎng)基上。
質(zhì)粒提取方法：
細(xì)菌的收獲可通過離心來進(jìn)行，而細(xì)菌的裂解可采用多種方法。這些方法包括用非離子型或離子型去垢劑、有機(jī)溶劑或堿進(jìn)行處理及用加熱處理等。選擇哪一種方法取決于3個(gè)因素：質(zhì)粒的大小、大腸桿菌菌株及裂解后用于純化質(zhì)粒DNA的技術(shù)。在實(shí)際操作中，可根據(jù)所使用的宿主菌及質(zhì)粒的特性來選擇合適的方法。本實(shí)驗(yàn)所介紹的堿裂解法提取質(zhì)粒的方法是一種簡便、快捷、效率高、消耗少的方法，適合于小量及大量、質(zhì)粒的提取。其原理是用EDTA和SDS破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使質(zhì)粒DNA分子，多聚核糖體及其他可溶物質(zhì)從細(xì)胞中逐步釋放，而染色體DNA分子與細(xì)胞碎片纏繞在一起，可經(jīng)離心與質(zhì)粒DNA分開。
質(zhì)粒電泳：
質(zhì)粒電泳一般采用瓊脂糖凝膠電泳。電泳是分離、鑒定和純化DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。該技術(shù)操作簡便、快速，可以分辨用其他方法所無法分離的DNA片段。此外，直接用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙錠進(jìn)行染色，可確定DNA在凝膠中的位置。少至1-10ng的DNA條帶即可直接在紫外燈下檢出。電泳后的DNA條帶還可以從凝膠中回收，用于克隆操作。
影響DNA在瓊脂糖凝膠中的遷移速率的因素有：
1）DNA分子的大??；2）DNA的構(gòu)象；3）瓊脂糖濃度；4）所用電壓；5）堿基組成及電泳溫度；6）電泳緩沖液的組成。
質(zhì)粒提取的實(shí)驗(yàn)步驟（詳見generay質(zhì)抽試劑盒說明書）
1. 取1～2ml過夜培養(yǎng)的菌液，12000rpm離心1min，棄盡上清。
注意：對于低拷貝數(shù)的質(zhì)粒，請用4～6ml菌液，通過多次離心將菌體收集到一個(gè)離心管中。
2. 加入200μl SolutionⅠ，用槍頭或振蕩器充分懸浮細(xì)菌。
注意：* 確認(rèn)Solution I中已加入RnaseA.
* 不要?dú)埩艏?xì)小菌塊，否則會影響裂解，導(dǎo)致提取量和純度偏低。
3. 加入200μl SolutionⅡ，立即溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合4～6次，使菌體充分裂解，直至形成透亮的蛋清狀溶液，此步驟不宜超過5min。
注意：* SolutionII使用后立即蓋緊瓶蓋，以免空氣中的CO2中和SolutionII中的NaOH發(fā)生中和反應(yīng)，降低溶菌效率。
* 避免劇烈搖晃，否則將導(dǎo)致基因組DNA的污染。
4. 加入350μlSolutionⅢ，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合8～10次，室溫放置2～5min。12,000rpm，離心10min。
注意：避免劇烈搖晃，否則將導(dǎo)致基因組DNA的污染。
5. 將步驟4中的上清轉(zhuǎn)移到套放于2ml收集管內(nèi)的GenCleanColumn中，室溫6000rpm 離心1min，取出GenCleanColumn，倒掉收集管中廢液。
注意：忌取到沉淀，否則會出現(xiàn)基因組DNA和蛋白質(zhì)污染。
6. 將GenClean Column重新放回收集管中，加入500μl SolutionIV，12,000rpm，室溫離心1min，倒掉收集管中廢液。
7. 將GenClean Column重新放回收集管中，加入500μl WashSolution，12,000rpm，室溫離心1min，倒掉收集管中廢液。
8. 重復(fù)步驟7一次。
9. 倒掉收集管中廢液，12,000 rpm，室溫離心1min，徹底去除WashSolution。
注意：此步驟高速空離是為了去盡殘留的乙醇，請勿省略，否則可能因所純化的核酸中殘留有乙醇而影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)效果。將GenClean柱室溫開蓋放置10min或50℃放置5min，將有助于徹底去除WashSolution中的乙醇。
10. 將GenClean Column放入干凈的1.5ml離心管中，在GenCleanColumn膜中央加入50μl～70μl ElutionBuffer，37℃放置2min。12,000rpm，室溫離心1min，離心管中的液體即為包含目的質(zhì)粒的溶液，取2～5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化好的DNA可立即用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)或-20℃凍存。
注意：將Elution Buffer或去離子水加熱至65℃將提高洗脫效率。
質(zhì)粒檢測：
1. 制備凝膠
稱1g瓊脂糖，放入250 mL三角瓶內(nèi)，加入100 mL1×TAE電泳緩沖液，加熱煮沸等其涼到60℃左右，倒入封好的電泳板上。
2. 上樣
1）吸取2 μL質(zhì)粒，加入1μL上樣緩沖液（Loading buffer），混勻。
2）將質(zhì)粒樣品點(diǎn)入到瓊脂糖凝膠的上樣孔中
3. 電泳
連接好電泳槽和電泳儀，以5V/cm恒壓電泳。
4. 染色及脫色
電泳1.5-2 h后，關(guān)上電泳儀。取出凝膠，放入染色槽內(nèi)，加入1滴溴化乙錠（EB）輕輕搖蕩15分鐘。將染色液倒入儲存桶內(nèi)，在染色槽內(nèi)加入自來水，輕輕搖蕩10分鐘。
5. 結(jié)果觀察
將凝膠放到紫外燈下觀測。記錄觀察到的電泳條帶
實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
質(zhì)粒沉淀離心后,在管底能見到少量白色物質(zhì)。
真空干燥后，無色，貼于管壁。
加ddH2O或TE能迅速溶解。
電泳凝膠上呈現(xiàn)一條亮帶。
如果質(zhì)粒提取中降解，則會出現(xiàn)上下三條帶，分別代表超螺旋、帶切口和帶切刻的質(zhì)粒。
溶解時(shí)不加RNase，則下部會有很亮的一片，為小分子RNA片段。
質(zhì)粒中含太多雜質(zhì)，則干燥后會呈白色或褐色，不易溶解。
常見問題分析
1．純化質(zhì)粒DNA時(shí)，一般使用多少菌體培養(yǎng)液比較合適?
根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，如為高拷貝質(zhì)粒（如：pUC18等)，使用2ml培養(yǎng)液與4ml培養(yǎng)液純化的質(zhì)粒DNA的收量差別不是很大，可以純化得到10～15μg的高純度質(zhì)粒DNA。我們一般使用2ml的菌體培養(yǎng)液進(jìn)行質(zhì)粒DNA提取。
2．本試劑盒對低拷貝質(zhì)粒的純化提取情況如何?
針對低拷貝質(zhì)粒時(shí)，使用4ml的菌體培養(yǎng)液進(jìn)行質(zhì)粒DNA的提取比較合適。如使用pBI121質(zhì)粒時(shí)，在4ml的菌體培養(yǎng)液中，可以純化提取2～3μg的高純度質(zhì)粒DNA。
3．為什么質(zhì)粒DNA的收量較低?
一般情況下，從2ml的LB培養(yǎng)基進(jìn)行過夜培養(yǎng)的pUC18/JM109培養(yǎng)液中，可以純化得到約10～15μg的高純度質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒DNA收量較低時(shí)，可以從以下幾個(gè)方面考慮：
（1）大腸桿菌太陳舊（在低溫下的長期保存菌等)。請涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)。
（2）質(zhì)?？截悢?shù)低。使用低拷貝數(shù)載體時(shí)，每次產(chǎn)出的質(zhì)粒DNA量會降低。
（3）確認(rèn)操作過程的嚴(yán)密性。應(yīng)嚴(yán)格按操作方法進(jìn)行操作。
4．為什么加入Solution II后的溶菌液不澄清?
（1）菌體量過多，不能充分溶菌。使用本試劑盒時(shí)，每次可處理的菌體培養(yǎng)液為1-2 ml。
（2）菌體沉淀懸浮不充分。在加入SolutionI后，應(yīng)使用振蕩器（Vortex）等進(jìn)行劇烈振蕩使菌體沉淀充分懸浮后再做溶菌處理。
5．為什么質(zhì)粒DNA測序結(jié)果不佳?
（1）模板DNA定量不準(zhǔn)。請對質(zhì)粒DNA正確定量。使用吸光度值定量時(shí)，有時(shí)DNA溶液中的不純物會影響吸光度值的測定，此時(shí)建議使用瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行定量。
（2）質(zhì)粒DNA純度不好。請嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)操作要求，使用新鮮菌體培養(yǎng)液提取質(zhì)粒。
（3）洗脫液中鹽離子濃度過高。建議進(jìn)行DNA洗脫時(shí)用滅菌蒸餾水洗脫。
（4）DNA插入片段本身立體結(jié)構(gòu)復(fù)雜。有些DNA立體結(jié)構(gòu)復(fù)雜（如GC rich、重復(fù)序列等）時(shí)難以測序，應(yīng)改進(jìn)測序方法。
